羅麗娜 牟大英 龔乾濤 劉茂永

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

宮頸癌是世界上第二種常見的婦科癌癥，全球每年有52萬新病例和27萬人死亡。大約30%的宮頸癌患者不能通過手術、放療或化療改善結(jié)局〔1〕。越來越多的證據(jù)表明，上皮細胞間質(zhì)化(EMT)在宮頸癌的發(fā)生中起著重要作用。EMT參與宮頸癌侵入和轉(zhuǎn)移〔2〕，誘發(fā)癌癥化學抗性和放射抗性〔3〕，并有免疫保護作用〔4〕。因此，探尋新的治療手段來調(diào)節(jié)EMT過程可能為宮頸癌的治療提供新思路?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的內(nèi)源性抑制劑，兩者形成非共價復合物從而抑制 MMPs 的活性，減少細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的破壞，保持細胞之間連接的完整性，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移，改善預后〔5〕。研究表明，MMPs/TIMPs 的不平衡可能導致 ECM 降解或沉積從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔6〕。相比較 TIMPs 其他家族成員而言，TIMP-2 在多數(shù)正常成人組織間隙有大量表達，能特異性抑制 MMP-2的活性從而減少 ECM 的降解，降低癌細胞的遷移能力。臨床病理證據(jù)表明TIMP-2 與腫瘤發(fā)展相關，例如在侵襲性胃癌及腎透明細胞癌的組織、食管癌和胃癌及非小細胞肺癌患者的血清中 TIMP-2表達水平均較低〔7〕。腫瘤組織中 TIMP-2 的表達水平較低，這可能與腫瘤的侵襲性增加有關；相反，上調(diào) TIMP-2 的表達，能抑制腫瘤的生長及增強腫瘤對化療藥物的敏感性〔8〕。然而，TIMP-2通過調(diào)控EMT過程在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮保護作用尚未闡明。因此，本研究建立宮頸癌細胞EMT模型，擬觀察人源TIMP-2對TGF-β1誘導宮頸癌細胞(HeLa)EMT的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 鈣黏附蛋白(E-cadhein)、波形蛋白(vimentin)、信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子(SNAIL)2、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、p-p70s6k、β-actin抗體購自Cell Signaling Technology 公司；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和人源TIMP2購自Sigma公司；CCK8購自同仁化學研究所；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；HeLa細胞購自上海然泰生物科技有限公司；雷帕霉素購自派普泰克生物科技(蘇州)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與處理 人宮頸癌細胞系HeLa培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素37℃，95%空氣和5%CO2培養(yǎng)箱中。實驗分組：TGF-β1組為HeLa給予10 ng/ml TGF-β1處理，PBS組為HeLa給予體積PBS處理，1，5，10，15，25 μg/ml，TIMP2組為HeLa給予1，5，10，15，25 μg/ml TIMP2處理，TIMP2+TGF-β1組為HeLa同時給予25 μg/ml TIMP2和10 ng/ml TGF-β1處理，Rapa組為HeLa給予mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapa)50 μmol/L 處理 Rapa+TGF-β1組為HeLa同時給予Rapa 50 μmol/L和10 ng/ml TGF-β1處理。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.2細胞活力測定 通過CCK-8測定法檢測細胞活力。細胞以1×104個細胞/孔接種到96孔板中，并在37℃下培養(yǎng)過夜。在24 h后接種，將指定濃度的TIMP2，同時給予TGF-β1處理，然后將細胞分別培養(yǎng)24、48和72 h。將CCK-8加入每個孔中，并在孵育1 h后，通過測定細胞活力測量轉(zhuǎn)化染料在450 nm處的吸光度，重復3次。

1.2.3劃痕實驗 在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，使其生長至90%。使用2 ml移液器槍頭進行劃痕。 用PBS洗滌3次后，細胞為用含有10 ng/ml TGF-β1的新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，有或無TIMP2處理24 h。遷移率通過量化在24 h的劃痕距離/0 h的劃痕距離。所有實驗重復3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測方法 將細胞以4×105個細胞/孔接種在6孔板中，然后用TIMP2處理，同時給予10 ng/ml TGF-β1刺激24 h。具體實驗步驟參照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒。

1.2.5Western印跡檢測 收集處理后的細胞裂解后，檢測E-cadhein、vimentin、STAT3、SNAIL2、PKM2、p-p70s6k的蛋白表達，將提取后的蛋白進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗4℃過夜孵育，用洗膜液漂洗后，二抗雜交1 h，清洗后加上化學發(fā)光劑(ECL)顯色，上機檢測。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1誘導宮頸癌細胞EMT TGF-β1組E-cadherin表達水平較PBS組明顯下降，而波形蛋白表達較PBS組明顯升高 (均P<0.05)。見圖1，表1。

表1 HeLa細胞E-cadherin與Vimentin的蛋白表達水平

圖1 TGF-β1誘導宮頸癌細胞對EMT標記蛋白表達

此外，HeLa細胞在TGF-β1刺激下都獲得了紡錘體和成纖維細胞的形狀，見圖2。

圖2 TGF-β1誘導宮頸癌細胞EMT(×400)

2.2TIMP2對HeLa細胞增殖，遷移，凋亡的影響 各劑量TIMP2組24～72 h細胞增殖能力均顯著低于PBS組，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。TGF-β1組24～72 h細胞增殖能力顯著高于PBS組，而TIMP2+TGF-β1組顯著低于TGF-β1組(均P<0.05)。見表2。TIMP2 (25 μg/ml)組24 h后細胞遷移指數(shù)(0.44±0.03)顯著小于PBS組(0.65±0.06，P<0.05)，TIMP2+TGF-β1組細胞遷移指數(shù)(0.52±0.03)顯著小于TGF-β1組(0.81±0.03,P<0.05)。表明TIMP2能明顯抑制TGF-β1誘導細胞遷移能力，見圖3。TIMP2組細胞凋亡率〔(58.25±7.24)%〕顯著高于PBS組〔(0.02±0.01)%，P<0.05〕，而TIMP2+TGF-β1組細胞凋亡率〔(41.35±4.33)%〕顯著高于TGF-β1組〔(1.32±0.02)%，P<0.05〕。見圖4。表明TIMP2能促進HeLa的凋亡，抑制增殖與遷移。

表2 TIMP2對Hela細胞增殖的影響

圖3 TIMP2對HeLa細胞遷移的影響(×100)

圖4 TIMP2對HeLa細胞凋亡的影響

2.3mTOR/p70s6k信號通路對Hela細胞的作用 TGF-β1組PKM2和p70s6k水平(10.63±0.06、2.68±0.04)顯著高于PBS組(4.12±0.03、1.95±0.06，P<0.05)，表明TGF-β1促活化mTOR/p70s6k信號通路。Rapa+TGFβ1組PKM2和p70s6k水平(6.82±0.05、1.52±0.03)顯著高于Rapa組(1.86±0.02、0.65±0.05，P<0.05)，見圖5。表明抑制mTOR途徑顯著降低HeLa中PKM2的表達和p70s6k的磷酸化。

2.4TIMP2對宮頸癌細胞EMT的作用及機制 TGF-β1組E-cadherin水平顯著低于PBS組，而STAT3，SNAIL2，vimentin水平顯著高于PBS組(P<0.05)。TIMP2組E-cadherin水平顯著高于PBS組(P<0.05)，而其他指標與PBS組比較無顯著差異(P>0.05)。TIMP2+TGF-β1組E-cadherin水平顯著高于TGF-β1組，而STAT3，SNAIL2，vimentin水平均顯著低于TGF-β 組(P<0.05)，見圖6。表明TIMP2逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導的EMT標志物表達。同時TIMP2+TGF-β1組p70s6k和PKM2水平均顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。見表3。與TGF-β1組比較，TIMP2+TGF-β1組HeLa細胞形成紡錘體和成纖維細胞形態(tài)程度低，見圖7。表明TIMP2處理完全阻斷了TGF-β1誘導的EMT形態(tài)學改變，TIMP2通過調(diào)控mTOR/p70s6k信號通路來抑制TGFβ1誘導HeLa細胞EMT過程。

1～4:DMSO組,TGF-β1組,TGF-β1+Rapa組,Rapa組圖5 mTOR/p70s6k信號通路對EMT的影響

1～4:PBS組，TGF-β1組，TIMP2組，TIMP2TGF-β1組圖6 TIMP2對宮頸癌細胞EMT的作用及機制

表3 TIMP2對HeLa細胞EMT及信號通路蛋白表達水平

圖7 TIMP2對宮頸癌細胞EMT形態(tài)學改變(×100)

3 討 論

本研究結(jié)果表明TIMP2抑制TGF-β1誘導的EMT過程是通過宮頸癌細胞中mTOR/p70s6k/PKM2信號通路。在子宮內(nèi)膜癌細胞系 HEC-1A 細胞中 miR-200b、胃癌細胞中 miR-106A、腎癌細胞中的 miR-221 均能通過調(diào)節(jié) TIMP-2 表達水平影響腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲〔9〕；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中 miR221/222 能靶向調(diào)節(jié) TIMP-2 水平進而影響細胞周期、細胞凋亡及血管的生成〔10〕。研究顯示血清中高濃度TIMP-2有更好的臨床預后，可能有助于癌癥患者術后的監(jiān)測和放化療〔11〕。腫瘤的高死亡率主要與其自身的浸潤和遠處轉(zhuǎn)移相關，因此，如今治療策略的重點是抑制腫瘤的生長〔12〕，阻止癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔13〕。

本研究結(jié)果表明TIMP2對宮頸癌的潛在治療意義。既往研究發(fā)現(xiàn)PKM2在癌癥的EMT發(fā)展中起著至關重要的作用〔14〕。PKM2是mTOR誘導的Warburg效應中重要的糖酵解酶，其中缺氧誘導因子(HIF)-1α和c-Myc-hnRNP是mTOR調(diào)控PKM2的效應分子〔15〕。PKM2在小鼠腎腫瘤中表達顯著增加，而被mTOR的激活所抑制〔13〕。這些研究提示mTOR/p70s6k信號傳導與EMT相關。本研究表明PKM2和p70s6k參與EMT過程，TIMP2抑制了p70s6k和PKM2的磷酸化。

綜上，TIMP2可通過抑制mTOR/p70s6k/PKM2信號通路抑制宮頸癌細胞EMT過程，表現(xiàn)為抑制細胞的增殖與遷移，促進腫瘤細胞凋亡。