王旭東 王亞麗 郭毅 陳超 袁青文 楊建平

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

膿毒癥是因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，研究發(fā)現(xiàn)，本病發(fā)病機(jī)制與發(fā)展過程較為復(fù)雜，在病情進(jìn)展中易伴膿毒癥休克，危重患者常伴多器官功能障礙綜合征，目前是危重病醫(yī)學(xué)中的難題〔1〕。臨床中，急性腎損傷(AKI)是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥，膿毒癥型AKI致死率高，目前尚無能夠有效評(píng)估病情的指標(biāo)〔2〕。微小RNA(miRNA)作為內(nèi)源性基因編碼的長度為21～23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，是直接由核苷酸酶DiceR剪切加工而成，在編碼蛋白質(zhì)中并未見作用〔3〕。研究報(bào)道其作用是直接通過特定靶基因的3′-非編碼區(qū)調(diào)控功能基因表達(dá)，使機(jī)體不同病理生理進(jìn)程受調(diào)節(jié)。近年來膿毒癥深入研究結(jié)果指出miRNA具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，且特異miR-22是評(píng)估膿毒癥患者診斷與預(yù)后的無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)，但具體對(duì)膿毒癥AKI患者的調(diào)控作用報(bào)道較少〔4，5〕。故本研究重點(diǎn)對(duì)miR-22在老年膿毒癥AKI中的作用及機(jī)制展開探討，期望確定miR-22在膿毒癥中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年3月徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU收治的老年膿毒癥患者60例作為研究對(duì)象，按照《KDIGO急性腎損傷臨床實(shí)踐指南》〔6〕每天評(píng)估患者是否發(fā)生AKI，以入選后7 d中是否發(fā)生AKI分為非AKI組(28例)與AKI組(32例)；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有入選患者符合《2001年國際膿毒癥定義會(huì)議關(guān)于膿毒癥診斷的新標(biāo)準(zhǔn)》〔7〕中膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；而AKI組符合《KDIGO急性腎損傷臨床實(shí)踐指南》中AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡65～74歲；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腎移植手術(shù)史者；(2)患終末期腎臟疾病者；(3)腎臟替代治療前入住過 ICU者；(4)已明確或疑似患腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、腎血管炎者；(5)梗阻引起的 AKI患者；(6)患腎臟腫瘤者；(7)低血容量性休克者；(8)心臟功能不全者、患甲狀腺疾病者。AKI組年齡65～74歲，平均年齡(66.67±2.85)歲；男21例，女11例；非AKI在年齡65～74歲，平均年齡(66.02±2.12)歲；男性18例，女性10例；兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且入選患者皆為自愿參與本研究，簽署知情同意書。

1.1.1膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《2001年國際膿毒癥定義會(huì)議關(guān)于膿毒癥診斷的新標(biāo)準(zhǔn)》，確診或疑似為感染者伴全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。SIRS滿足以下2項(xiàng)以上即可診斷：①體溫超過38℃或低于36℃；②心率每分鐘超過90次，不包括給予降心率藥物或裝置起搏器者；③呼吸每分鐘超過20次，或動(dòng)脈血氧二氧化碳分壓(PaCO2)<32 mmHg，或機(jī)械通氣；④白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109/L或<4×109/L，或幼稚細(xì)胞(桿狀核)>10%。

1.1.2AKI診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《KDIGO急性腎損傷臨床實(shí)踐指南》相關(guān)內(nèi)容制定：48 h內(nèi)血清肌酐(SCr)升高26.4 μmol/L(0.3 mg/dl)或≥50%；或尿量<0.5 ml/(kg·h)，連續(xù)6 h以上。

1.2方法 收集所有入選患者的基本資料：包括體溫、呼吸頻率、心率、收縮壓、舒張壓、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、急性生理與慢性健康(APACHE Ⅱ)評(píng)分、全身性感染相關(guān)性器官衰竭(SOFA)評(píng)分、腦鈉肽(BNP)、氧合指數(shù)、ICU滯留時(shí)間及平均住院天數(shù)等。APACHE Ⅱ評(píng)分最高為71分，分?jǐn)?shù)越高表明預(yù)后效果越差〔7〕；SOFA評(píng)分最高為24分，分?jǐn)?shù)越高表明預(yù)后效果越差〔8〕。

1.2.1樣本的采集 所有入選患者在達(dá)到相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)入ICU后24 h內(nèi)采集晨起空腹外周靜脈血液5 ml與尿液標(biāo)本5 ml；本研究所使用的患者血液樣本均由徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU提供。采血管均已事先進(jìn)行去RNA酶處理；采用熒光定量PCR檢測所有血清樣本中miR-22的表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清樣本中高遷移率族蛋白(HMG)B1的含量、全自動(dòng)生化分析儀測定SCr、胱抑素(Cys)-C水平。尿液標(biāo)本經(jīng)2 000 r/min常溫離心20 min后獲取上清液密封，每份編號(hào)后存放于-20℃冰箱中，采用ELISA試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀測定尿液腎損傷分子(KIM)-1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)水平。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用生物學(xué)軟件預(yù)測miR-22的靶基因，分別構(gòu)建HMGB1 3′UTR野生型(WT)和HMGB1 3′UTR突變型(Mut)質(zhì)粒載體并將之分別與miR-22 mimic共轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞(人腎母細(xì)胞G401，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)。

1.2.3采用熒光素酶法檢測 HMGB1蛋白表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗24孔板中培養(yǎng)液2遍，避免出現(xiàn)PBS殘留，將各孔中置入裂解液，取1.5 ml細(xì)胞放入新EP管并置入在4℃環(huán)境中離心3 min，上機(jī)讀數(shù)并應(yīng)用發(fā)光檢測儀測定熒光素酶底物活性，取數(shù)值A(chǔ)后，再向管中添加Stop液100 μl，取數(shù)值B，計(jì)算熒光活性，重復(fù)3次取平均值。

1.2.4Western印跡檢測法 miR-22 mimic轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞HMGB1 24 h，添加100 mg∶1 ml的強(qiáng)裂解液，5%脫脂牛奶封閉1 h后，一抗4℃中過夜；二抗室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑發(fā)光顯影，以內(nèi)參GAPDH條帶作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平作為參照。

1.3觀察指標(biāo) 觀察兩組患者血清中miR-22表達(dá)水平，根據(jù)miR-22不同表達(dá)水平分析與膿毒癥AKI的臨床參數(shù)關(guān)系(ScR、Cys-C、KIM-1、NGAL與血清HMGB1含量水平；miR-22靶向基因表達(dá)情況、miR-22調(diào)節(jié)膿毒癥急性腎損傷細(xì)胞中HMGB1 mRNA蛋白表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組常規(guī)指標(biāo)比較 AKI組APACHE Ⅱ、SOFA、BNP高于非AKI組，ICU滯留時(shí)間、住院天數(shù)短于非AKI組；而AKI組氧合指數(shù)低于非AKI組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 兩組常規(guī)指標(biāo)比較

2.2兩組血清中miR-22表達(dá)水平 AKI組miR-22表達(dá)水平顯著高于非AKI組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.34±0.39 vs 1.02±0.35;t=3.325,P=0.002)。

2.3miR-22不同表達(dá)水平與膿毒癥急性腎損傷臨床病理參數(shù)的關(guān)系 AKI組中32例患者血清中miR-22相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，其平均增高倍數(shù)(5.20倍)作為節(jié)點(diǎn)，把miR-22水平分為低表達(dá)組(18例)與高表達(dá)組(14例)，低表達(dá)組SCr、Cys-C、KIM-1顯著低于高表達(dá)組，而低表達(dá)組NGAL顯著高于高表達(dá)組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-22的表達(dá)水平與膿毒癥急性腎損傷臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4各組血清HMGB1含量水平 高表達(dá)組中HMGB1水平〔(137.63±24.95)ng/ml〕顯著高于低表達(dá)組與非AKI組〔(105.27±16.95)ng/ml、(98.74±15.97)ng/ml；P<0.05〕；而低表達(dá)組血清HMGB1含量水平明顯高于非AKI組(P<0.05)。

2.5miR-22靶向基因表達(dá) 與轉(zhuǎn)染miR-22 mimic和 HMGB1 3′UTR Mut的非AKI組比較，低表達(dá)組與高表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-22 mimic與 HMGB1 3′UTR Mut人腎母細(xì)胞中熒光酶活性下降(P<0.05)；但3組轉(zhuǎn)染miR-22 mimic與HMGB1 3′UTR WT的膿毒癥急性腎損傷細(xì)胞中熒光酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組轉(zhuǎn)染HMGB1 3′UTR WT和HMGB1 3′UTR Mut后miR-22表達(dá)比較

2.6miR-22調(diào)節(jié)膿毒癥急性腎損傷中HMGB1蛋白表達(dá) 與轉(zhuǎn)染的非AKI組(1.56±0.20)比較，低表達(dá)組(1.37±0.41)、高表達(dá)組HMGB1蛋白表達(dá)(1.14±0.20)明顯下降(t=6.951、2.032；P=0.000、0.049)，且高表達(dá)組HMGB1蛋白明顯低于低表達(dá)組(t=2.088；P=0.045)，見圖1；細(xì)胞中熒光素酶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組中HMGB1蛋白相應(yīng)的熒光強(qiáng)度(1.63±0.35)顯著高于低表達(dá)組(1.27±0.42)與非AKI組(1.30±0.39；t=2.582、2.671；P=0.015、0.011)，見圖2。提示miR-22可調(diào)控HMGB1蛋白翻譯過程，從而下調(diào)HMGB1蛋白表達(dá)。

圖1 HMGB1蛋白檢測

A、B、C依次是：藍(lán)光激發(fā)細(xì)胞核熒光、綠光激光靶向蛋白熒光、自然光下細(xì)胞圖2 3組腎細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)熒光素酶檢測結(jié)果

3 討 論

miRNA中的miR-22是一種微小內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，miR-22具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)，經(jīng)過特定的信號(hào)通路作用膿毒癥與并發(fā)癥發(fā)生環(huán)節(jié)〔8，9〕。文獻(xiàn)報(bào)道采用二代測序技術(shù)對(duì)膿毒癥患者血清中miR-22表達(dá)與正常群體進(jìn)行對(duì)比檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的血清miR-22表達(dá)顯著生升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵病理生理過程中具有調(diào)控作用的功能性基因，說明在膿毒癥致病過程中miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)鍵作用〔10～12〕。

急性腎損傷作為膿毒癥中發(fā)病率較高的并發(fā)癥之一，炎癥因子大量釋放與足細(xì)胞侵損是關(guān)鍵致病機(jī)理，而miR-22在并發(fā)過程中具有調(diào)節(jié)作用〔13〕。Tang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者外周循環(huán)血清中miR-22水平表達(dá)顯著升高，尤其是膿毒癥AKI患者miR-22表達(dá)水平明顯高于非AKI患者，應(yīng)用基因組數(shù)據(jù)庫研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-22主要對(duì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、兔尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5靶向表達(dá)調(diào)控，對(duì)膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷患者腎臟組織能量代謝、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、腎小管細(xì)胞侵損等均有作用。Cys-C屬于糖基化小分子蛋白，在血中生成量穩(wěn)定，且無其他影響因素，個(gè)體間變異率小，其濃度與內(nèi)生Scr清除率呈負(fù)相關(guān)，是臨床反映腎小球?yàn)V過率的同源性標(biāo)志物〔15～17〕。KIM-1作為新型跨膜糖蛋白，常見于腎損傷的近端腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，對(duì)腎前性氮質(zhì)血癥存在良好的特異性與敏感性，且慢性腎病或尿路感染不會(huì)對(duì)其造成影響〔18〕。NGAL通常不常見于腎組織中，但發(fā)生缺血性損傷后，腎小管升支段分泌功能升高，NGAL大量出現(xiàn)，尿液中NGAL濃度驟增，說明miR-22能下調(diào)Cys-C、Scr、KIM-1水平；上調(diào)NGAL可加重腎小管細(xì)胞侵損，加快刺激膿毒癥急性腎損傷進(jìn)程變化〔19〕。HMGB1作為新的晚期炎癥介質(zhì)，在膿毒癥患者病情受炎癥以你這刺激或細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后大量釋放、分泌，與不同炎癥介質(zhì)共同作用，讓機(jī)體炎癥范圍擴(kuò)散，致膿毒癥患者發(fā)生臟器功能損傷，常見為AKI〔20〕。本研究提示miR-22高表達(dá)組中HMGB1呈高表達(dá)。本研究結(jié)果提示miR-22可調(diào)控HMGB1 mRNA翻譯過程，從而下調(diào)HMGB1蛋白表達(dá)。