孔倩倩，陳飛，白曉雨，張娟*

（1.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 211100；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司 細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)部，上海 200131）

近年來，隨著單克隆抗體（Monoclonal Antibody，mAb）市場規(guī)模的擴大，以全人源化抗體為主導(dǎo)，雙特異性抗體（Bispecific antibody，BsAb）、抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）等改良型抗體先后問世，可有效治療多種疾病[1]。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是生物制藥的首選生產(chǎn)平臺，能夠提供特定的翻譯后修飾，其表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。由于具有可在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)、被動物病毒污染風(fēng)險低、較少分泌內(nèi)源性蛋白且易于基因改造的特點，中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary，CHO）細胞已作為治療性蛋白生產(chǎn)的主要宿主細胞[2]。

正常細胞狀態(tài)下，胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）可 被 谷 胱 甘 肽（Glutathione，GSH）等抗氧化防御系統(tǒng)中和，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。在CHO 細胞生產(chǎn)外源蛋白的過程中，高水平表達往往加劇培養(yǎng)過程中的氧化壓力，不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件和工藝控制條件則會進一步引起胞內(nèi)ROS 和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化損傷嚴重時可導(dǎo)致凋亡、線粒體功能紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，影響細胞正常生理活動[3]。

因此，緩解細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)的氧化應(yīng)激，在改善生長代謝以及提高抗體產(chǎn)量方面具有重要意義。目前，基因工程、抗氧化型添加劑和培養(yǎng)過程控制是應(yīng)用較為廣泛的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)手段，可有效減少ROS的產(chǎn)生或增強CHO 細胞抗氧化能力以維持氧化還原平衡。

1 哺乳動物細胞培養(yǎng)與氧化應(yīng)激

1.1 活性氧及其來源

活性氧（ROS）是含氧且具有高度化學(xué)活性的幾種分子的總稱，主要包括超氧陰離子（O2－·）、羥自由基（OH·）等自由基分子，以及過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）等非自由基分子。ROS 作為信號分子，介導(dǎo)胞內(nèi)許多生理過程[4]。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的物質(zhì)還可以與O2、光照或其他成分相互作用而產(chǎn)生ROS[8]。例如核黃素對光敏感，光照下可產(chǎn)生大量ROS，培養(yǎng)基中存在色氨酸、酪氨酸、葉酸、吡哆醇時，還可以進一步促進核黃素產(chǎn)生ROS[9]。葉酸在光照和O2存在時降解，也可生成ROS[10]。且商業(yè)培養(yǎng)基中通常缺乏抗氧化劑，添加抗壞血酸、兒茶素等抗氧化劑時，也需考慮它們的穩(wěn)定性，以及是否可與其他成分反應(yīng)生成ROS[11-12]。

1.2 細胞內(nèi)的抗氧化防御

細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)包括酶類和非酶類抗氧化劑，可通過直接清除ROS、抑制ROS 產(chǎn)生或上調(diào)抗氧化能力等方式維持ROS 穩(wěn)態(tài)。

酶類抗氧化劑又可分為一級和二級[13]。一級抗氧化酶可催化ROS 轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的分子。例如，超氧化物歧化酶（SOD）通過還原催化O2－·歧化為H2O2，降低ROS 毒性；過氧化氫酶（CAT）可高效催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O 和O2；谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）利用GSH 作為還原劑，清除H2O2，還可催化脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇[14]。二級抗氧化酶可與其他內(nèi)源性抗氧化劑協(xié)同作用，間接中和ROS。例如，谷胱甘肽還原酶（GR）利用NADPH 作為還原劑，催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）再生成GSH，維持胞內(nèi)GSH 水平；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）參與磷酸戊糖途徑時，再生NADPH[13]。

上述大分子抗氧化酶是胞內(nèi)ROS 清除的主要途徑，同時也有小分子抗氧化劑，直接清除或作為酶系統(tǒng)的輔助因子參與維持氧化還原平衡。細胞內(nèi)的非酶類抗氧化劑可根據(jù)溶解性分為兩類：一類為水溶性，如GSH、抗壞血酸、半胱氨酸及金屬結(jié)合蛋白等；另一類為脂溶性，如α-生育酚、輔酶Q 等[15]。他們與抗氧化酶共同作用，與細胞內(nèi)的ROS 抗衡。

1.3 氧化應(yīng)激的影響

細胞內(nèi)ROS 生成增加或抗氧化能力降低，使平衡出現(xiàn)紊亂時，將引起氧化應(yīng)激、氧化還原信號和控制中斷和/或分子損傷。細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基成分和高糖高氧環(huán)境可提高ROS 水平，培養(yǎng)體系惡化、內(nèi)外源抗氧化劑耗竭也可降低細胞抗氧化防御能力[16]。

當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時，胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)首先增強，通過清除ROS 拮抗氧化系統(tǒng)；但當(dāng)氧化壓力超出拮抗能力時，將引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，甚至細胞出現(xiàn)損傷。胞內(nèi)過多ROS 會導(dǎo)致DNA堿基修飾或缺失、鏈斷裂、雙鏈畸變等形式的DNA 損傷，而后引發(fā)DNA修復(fù)、細胞周期延遲甚至細胞凋亡。其中，線粒體DNA 極易受到氧化損傷，且呼吸鏈產(chǎn)生的ROS 導(dǎo)致的線粒體DNA 損傷能反過來使呼吸鏈功能失效，進一步促進ROS 產(chǎn)生。ROS 可氧化修飾蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等，介導(dǎo)肽裂解，引起蛋白質(zhì)與脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)形成交聯(lián)，使其正常功能受損，或出現(xiàn)沒有功能的堆積，進而導(dǎo)致細胞損傷。ROS 還可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，促使其氧化或過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，使生物膜的流動性降低，最終改變膜通透性、膜受體、膜蛋白酶和離子通道活性，影響眾多生物學(xué)功能[4]。

ROS 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是造成細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)途徑、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、核因子（NF-kB）通路、Caspase 和Bcl-2 家族等機制使細胞凋亡。在培養(yǎng)過程中，上述生物大分子氧化損傷嚴重時，將導(dǎo)致線粒體功能紊亂和代謝效率降低，且影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和結(jié)構(gòu)修飾，對細胞生長代謝和蛋白產(chǎn)量質(zhì)量不利。

2 基因工程

運用基因編輯和基因干擾等技術(shù)，減少產(chǎn)生ROS的代謝活動或增強細胞抗氧化防御能力，理論上可以緩解培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的氧化應(yīng)激。但通過調(diào)控相關(guān)基因減少ROS 生成，可能影響細胞代謝產(chǎn)能、蛋白質(zhì)折疊等基本生理過程，不利于實際生產(chǎn)。因此，通常運用基因工程提高細胞抗氧化能力。

最初，研究者在CHO 細胞中表達hMn-SOD[17]和hGR[18]，明顯提高了細胞對氧化損傷的抵抗能力。有研究在CHO 細胞中過表達?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白（Taurine Transporter，TAUT），發(fā)現(xiàn)GSH 的前體谷氨酰胺消耗增加，認為TAUT 提高了胞內(nèi)GSH 水平而緩解了氧化損傷及凋亡，有效延長培養(yǎng)時間并使單抗產(chǎn)量提高近50%[19]。通過代謝組學(xué)[20]和蛋白質(zhì)組學(xué)[21]分析發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)CHO 細胞表現(xiàn)出更高的GSH含量。在此基礎(chǔ)上，研究者建立穩(wěn)定表達谷氨酸半胱氨酸連接酶（Glutamate Cysteine Ligase，Gcl）兩種亞基的CHO 細胞系以增加GSH 合成，發(fā)現(xiàn)過表達其修飾亞基Gclm 可提高70%單抗產(chǎn)量，而過表達其催化亞基Gclc 雖產(chǎn)生更多GSH，但未提高單抗產(chǎn)量[22]。還有研究者采用蛋氨酸磺基肟（Methionine Sulfoximine，MSX）和丁硫氨酸-亞砜胺（L-Buthionine Sulfoximine，BSO）抑制GS-CHOKISV 細胞系的Gcl活性，單抗產(chǎn)量反而提高1 倍，可能由于GSH 耗竭促進了其從頭合成途徑，阻止細胞分裂并伴隨著PDI/ERO1 維持在活躍的氧化態(tài)而促進蛋白合成[23]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在CHO-DG44 細胞系中采用BSO 抑制Gcl 活性，使GSH 顯著耗竭時，63 種蛋白質(zhì)表達水平發(fā)生變化以適應(yīng)氧化應(yīng)激，細胞生長和生產(chǎn)下降[24]。盡管關(guān)于調(diào)控CHO 細胞GSH 合成途徑的研究存在不一致的結(jié)果，但該方向依然為CHO 細胞改造提供了可行思路。

此外，一些轉(zhuǎn)錄因子、抗凋亡蛋白或miRNA 的研究也取得了成果。已知激活轉(zhuǎn)錄因子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在CHO 細胞中過表達ATF4 使抗體產(chǎn)量增加到2.4 倍[25]。將人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）在CHO 細胞中過表達，在氧化應(yīng)激和血清剝奪條件下，提高了活率和抗體產(chǎn)量[26]。使用miRNA 海綿耗竭miR-23，使CHO 細胞線粒體活性升高，抗氧化蛋白中TXNRD1 和PRDX6表達量升高，氧化防御能力增強，最終酶產(chǎn)量平均提高3 倍[27]。

上述通過改造與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶、轉(zhuǎn)錄因子或蛋白表達的研究，在減少細胞凋亡和提高抗體產(chǎn)量方面已有所突破。值得注意的是，抗氧化與調(diào)控凋亡和蛋白生產(chǎn)的關(guān)系十分復(fù)雜，也可能在不同選擇系統(tǒng)的CHO 細胞中表現(xiàn)不同。并且這些改造大部分處于研究階段，暫未運用于大規(guī)模生產(chǎn)，其工業(yè)化應(yīng)用可行性仍需進一步評估。

3 抗氧化型添加劑

在培養(yǎng)過程中，環(huán)境惡化導(dǎo)致胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)無法與大量產(chǎn)生的ROS 抗衡時，添加一些外源性抗氧化劑可清除ROS 或穩(wěn)定培養(yǎng)基成分，有助于緩解氧化應(yīng)激，改善細胞生長及生產(chǎn)。抗氧化劑可分為硫醇化合物、維生素、微量元素及螯合劑和多元酚類，它們在CHO 細胞培養(yǎng)中的作用見表1。

表1 CHO 細胞培養(yǎng)時添加的抗氧化劑及其作用

添加時需考慮抗氧化劑自身穩(wěn)定性、是否可與培養(yǎng)基中成分反應(yīng)生成ROS 以及培養(yǎng)基中成分配比，避免抗氧化劑濃度過高時轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸饔谩?/p>

4 培養(yǎng)過程控制

除了運用基因工程和添加抗氧化劑外，培養(yǎng)時合理控制溫度、pH、溶解氧含量（dissolved oxygen，DO）、二氧化碳分壓（pCO2）、攪拌速率以及補料流加速率等工藝參數(shù)，使細胞維持良好氧化還原狀態(tài)，也是改善生產(chǎn)的關(guān)鍵方面。

動物細胞開放培養(yǎng)通常在5% CO2環(huán)境中，氧壓力高達150 mmHg，高O2水平會增加ROS 產(chǎn)生[16]。而實際大規(guī)模生產(chǎn)時，DO 值通常控制在20%～80%，一般不會出現(xiàn)高氧誘導(dǎo)ROS 大量生成，但隨著細胞生長代謝，O2含量將大幅波動，且培養(yǎng)體積越大，培養(yǎng)基表面和下層細胞間的氧濃度梯度會越嚴重，甚至出現(xiàn)局部缺氧的狀況[53]。研究發(fā)現(xiàn)，CHO 細胞在高氧壓力下具有更高的GSH 水平，而氧壓力過高時GSH 不足以抵抗氧化應(yīng)激，細胞生長將受到抑制，且從缺氧到復(fù)氧狀態(tài)，細胞對O2的敏感性增加[54]，升高的O2水平又可引起細胞再氧化產(chǎn)生ROS[55]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，DO 值在20%～75%時，CHO 細胞生長狀態(tài)相似，但胞內(nèi)氧化還原和單抗產(chǎn)量差異顯著；隨著溶解的O2增加，胞內(nèi)H2O2增加，而還原酶活性相似，胞內(nèi)抗氧化機制難以控制氧化應(yīng)激[56]。因此，考慮到氧含量對胞內(nèi)氧化還原平衡的潛在干擾，需嚴格控制通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，維持培養(yǎng)體系O2均勻，并盡量降低剪切力造成的細胞損傷[2]。

葡萄糖是培養(yǎng)基中最主要的能源物質(zhì)，濃度高時誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS 大量生成和細胞凋亡[57]。CHO 細胞培養(yǎng)時，應(yīng)合理選擇培養(yǎng)基和補料策略，嚴格控制體系中葡萄糖濃度，避免濃度過高引起乳酸累積或濃度過低影響正常代謝和蛋白糖基化。

研究顯示，不同培養(yǎng)模式間也存在氧化壓力的差別，灌流培養(yǎng)與補料分批培養(yǎng)相比，CHO 細胞在生長穩(wěn)定期由重金屬離子和線粒體產(chǎn)生的H2O2減少，GSH/GSSG 比例提高，維持了良好的氧化還原環(huán)境而有效減輕二硫鍵錯配，最終表現(xiàn)為更高的活率和產(chǎn)量，以及更低的雙抗聚集體[58]。

上述關(guān)于O2、葡萄糖濃度和培養(yǎng)模式的研究，再次強調(diào)了細胞培養(yǎng)過程中維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要性。

5 展望

目前，隨著高細胞密度和高產(chǎn)量的CHO 細胞培養(yǎng)工藝發(fā)展，高水平代謝活動和副產(chǎn)物累積引起的氧化壓力增加及其導(dǎo)致的氧化應(yīng)激不容忽視。由于ROS 具有高反應(yīng)性、動態(tài)性、空間分布復(fù)雜的特點，且胞內(nèi)同時存在多種抗氧化物，不同部位的氧化還原能力與耐受能力也不同，在培養(yǎng)過程的動態(tài)環(huán)境變化下，難以精確監(jiān)測ROS 水平?；蚬こ淘谔岣呒毎寡趸烙芰Α⒖沟蛲?、調(diào)節(jié)代謝、提高蛋白表達和改善糖基化方面已有眾多研究，但研究成果尚未得到全面的工業(yè)化應(yīng)用。添加抗氧化劑可調(diào)控氧化還原內(nèi)環(huán)境，但額外添加不一定有利，實際應(yīng)用時需考慮細胞狀態(tài)和培養(yǎng)基成分，以及這些試劑對培養(yǎng)基貯存、蛋白純化分析、殘留量檢測等方面的影響。培養(yǎng)過程控制，尤其是保持合適O2水平，則在放大生產(chǎn)時充滿技術(shù)挑戰(zhàn)。