趙佳茜，朱長(zhǎng)俊，劉蘭，楊邱嫻，田建霞

（嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314000）

樺褐孔菌具有多種藥理活性成分如多糖、萜類、酚酸類、黑色素類及木質(zhì)素藥用真菌，被應(yīng)用于糖尿病、癌癥等多種疾病的防治和治療，且長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)表明使用樺褐孔菌無毒副作用[1]。糖尿病是一種代謝性疾病，通常會(huì)對(duì)腎臟造成不可逆的傷害。使用合成藥物會(huì)產(chǎn)生低血糖、胃腸道不適、腹瀉、肥胖、皮疹、腿部或腳踝腫脹以及乳酸中毒等不良反應(yīng)或毒副作用。天然藥物及其有效成分在治療糖尿病方面作用溫和、穩(wěn)定、持久且毒副作用比較低，對(duì)天然藥物降血糖活性成分的發(fā)現(xiàn)為糖尿病患者的預(yù)防治療和康復(fù)提供了新的途徑[2]。

本實(shí)驗(yàn)室在前期進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)確定了使用60%醇沉?xí)r得到樺褐孔菌多糖的含量與活性最高的基礎(chǔ)上使用多糖對(duì)經(jīng)由腹腔注射造模而成的糖尿病模型小鼠進(jìn)行降血糖實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠血清中甘油三酯（TG）含量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其進(jìn)行更加全面的研究，以彌補(bǔ)當(dāng)前國(guó)內(nèi)關(guān)于樺褐孔菌研究上的缺乏。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

40 只SPF 級(jí)別C57BL/6J 雄性小鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院SPI 級(jí)動(dòng)物房；樺褐孔菌，購(gòu)于杭州百山祖生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶，合肥巴斯夫生物科技有限公司；無水碳酸鈉、葡萄糖、硫酸、苯酚，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶，阿拉丁公司；鹽酸二甲雙胍，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。以上試劑均為分析純。

UV-1100 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；血糖儀和血糖試紙，三諾生物傳感股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌多糖的提取

取樺褐孔菌子實(shí)體100.0 g，加1 000 mL 去離子水，加熱2 h，補(bǔ)充損失的水分。三層紗布過濾2 次，抽濾2 次，棄濾渣，得水提物，40 ℃烘干，稱取4.00 g，去離子水定容至50 mL，取2.5 mL 于離心管中，再加入3.75 mL 無水乙醇，使乙醇的體積濃度為60%，混勻，4 000 r/min 條件下離心20 min，回收沉淀并烘干，得60%乙醇沉淀粉末備用。

1.3.2 樺褐孔菌水提物的多糖含量測(cè)定

取6 只試管，分別加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 葡萄糖溶液（0.1 mg/mL），加去離子水至1.0 mL，加苯酚溶液（50 g/L）1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，混勻，靜置10 min，沸水浴15 min，冷卻15 min，于485 nm 處測(cè)定吸光值，以去離子水作為參比溶液，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線；取25 mg 粉末定容至25 mL，取1.0 mL，方法同上，測(cè)定吸光值，計(jì)算多糖含量[3]。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)

1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液；5 mmol/L PNPG 溶液；0.2 mol/L Na2CO3溶液；pH 為6.8 的磷酸緩沖液；按表1 的方式進(jìn)行添加（PNPG 和α-葡萄糖苷酶均用磷酸緩沖液溶解）。

表1 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)溶液添加

表2 小鼠分組情況

取400 μL 樣品于試管中，加入20 μL 的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃保溫10 min，再加入PNPG 200 μL 啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃保溫30 min 后加入5 mL Na2CO3終止酶反應(yīng)過程，405 nm 處測(cè)吸光值，以去離子水作為參比溶液，每組3 次，記為A1；磷酸緩沖液代替樣品溶液作為空白對(duì)照，記為A0；磷酸緩沖液代替PNPG 溶液，記為A2。根據(jù)公式（1）計(jì)算抑制率[4-5]。

1.3.4 小鼠糖尿病病理模型建立

小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d，禁食不禁水16 h，測(cè)體重，尾尖取血，測(cè)空腹血糖；腹腔注射四氧嘧啶溶液0.24 mg/g，注射3 d 后，小鼠再次禁食不禁水16 h，測(cè)體重和空腹血糖。

1.3.5 小鼠造模后給藥分組

上述小鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只，見表2。每7 d測(cè)量一次體重和空腹血糖。

表1 多糖含量

表2 多糖抑制率

1.3.6 葡萄糖耐受性及胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)

小鼠禁食不禁水12 h 后，測(cè)體重和空腹血糖，此時(shí)血糖為小鼠注射0 min 的血糖值。適應(yīng)0.25 h，開始腹腔注葡萄糖溶液，劑量為2 g/kg。注射后0.25 h、0.50 h、1.00 h、1.50 h、2.00 h、2.50 h 和3.00 h 測(cè)量小鼠的血糖值；將小鼠禁食不禁水6 h，測(cè)體重和空腹血糖，此時(shí)血糖為小鼠注射0 min 的血糖值。適應(yīng)0.25 h，開始腹腔注射胰島素溶液，劑量為5×10-4U/g。注射后0.25 h、0.50 h、1.00 h、1.50 h、2.00 h、2.50 h和3.00 h 測(cè)量小鼠的血糖值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS軟件進(jìn)行描述性分析、t檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌多糖含量測(cè)定及對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

經(jīng)測(cè)定得圖1 溶液中葡萄糖濃度和吸光值成線性關(guān)系為y=16.76x-0.003 4，R2=0.999 8。經(jīng)過9 組實(shí)驗(yàn)后，計(jì)算出樺褐孔菌多糖的平均含量為15.31%。多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到75.42%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 糖尿病小鼠模型建立

在使用四氧嘧啶連續(xù)注射3 d 后，小鼠空腹血糖在13.9 ～17.3 mmol/L，高于11.1 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。

2.3 樺褐孔菌多糖對(duì)糖尿病小鼠的影響

如圖2 所示，使用樺褐孔菌多糖（二甲雙胍為陽性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照）連續(xù)灌胃21 d，對(duì)照組小鼠血糖明顯升高，其余4 組小鼠血糖顯著下降，說明樺褐孔菌多糖具有良好的降血糖的作用。高濃度組與二甲雙胍組小鼠血糖無明顯差異，說明該劑量樺褐孔菌多糖和相當(dāng)濃度的二甲雙胍具有相當(dāng)?shù)慕笛切Ч?/p>

圖2 小鼠血糖變化圖

2.4 小鼠葡萄糖耐受性、胰島素敏感性分析

小鼠注射葡萄糖后血糖變化如圖3 所示，在0 ～0.5 h 內(nèi)血糖升高，0.5 ～2.5 h 血糖下降，二甲雙胍組、中濃度組和高濃度組在注射1.5 h 后血糖恢復(fù)到初始水平，低濃度在2.0h 恢復(fù)正常，對(duì)照組在2.5 h 恢復(fù)初始，說明樺褐孔菌多糖可以增強(qiáng)小鼠的葡萄糖耐受能力。

圖3 葡萄糖耐受性測(cè)試

圖4 為注射胰島素以后血糖濃度，二甲雙胍組、中濃度組和高濃度組均在1.5 h 恢復(fù)到初始水平，而低濃度組和對(duì)照組的恢復(fù)時(shí)間是2 h，說明樺褐孔菌能夠提高胰島素敏感性。綜合葡萄糖耐受性、胰島素敏感性分析，樺褐孔菌多糖能夠增強(qiáng)小鼠的葡萄糖耐受能力和胰島素敏感能力，快速促進(jìn)小鼠紊亂的糖代謝恢復(fù)正常，進(jìn)而抑制糖尿病的惡化。該劑量中、高濃度組的樺褐孔菌多糖具有相當(dāng)濃度的二甲雙胍恢復(fù)紊亂的糖代謝的效果。

圖4 胰島素敏感性測(cè)試

3 結(jié)論

樺褐孔菌多糖對(duì)于糖尿病病理性小鼠有明顯的降血糖作用，可以增強(qiáng)小鼠的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性。樺褐孔菌多糖對(duì)于糖尿病的干預(yù)作用可能來源于其對(duì)于小鼠紊亂的糖代謝快速促進(jìn)恢復(fù)正常，進(jìn)而抑制糖尿病的惡化。本研究可以為將來探究樺褐孔菌多糖對(duì)于糖尿病的干預(yù)作用機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)。