汪艷平，韋正，張鵬，藍(lán)建京，陳海林，韋飛燕，張暉英

（河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西河池 546300）

山豆根是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根莖，又名苦豆根、廣豆根、小黃連、三小葉山豆根、胡豆蓮和柔枝槐等。2015版《中國(guó)藥典》記載，作為一味傳統(tǒng)的中藥材，山豆根具有清熱解毒、消腫利咽、泄火滋潤(rùn)等功效[1]，主治口燥咽干、舌紅苔黃、咽喉腫痛、牙齦腫痛、肺熱咳嗽以及便秘尿黃等諸多臨床病癥[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，山豆根的黃酮類和生物堿類成分在抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎及提高免疫力方面都有功效[3-6]。山豆根主要含有苦參堿、氧化苦參堿、金雀花堿和甲基金雀花堿等生物堿[7-8]，高麗槐素、三葉豆紫檀苷、山豆根色滿二氫黃酮、槲皮素、蘆丁等黃酮類[9]，羽扇豆醇、槐花二醇等三萜類和小分子酚及其他化學(xué)成分[10]。隨著社會(huì)對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥關(guān)注度的提升，篩選山豆根活性成分的最佳提取工藝在醫(yī)藥領(lǐng)域和工業(yè)生產(chǎn)方面均具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)利用信息熵來計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，為中藥材提取的綜合評(píng)價(jià)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

山豆根藥材，購自廣西河池市宜州區(qū)藥材市場(chǎng)，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根莖。

苦參堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-18040911，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.00%）、氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-18041310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.00%）、金雀花堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-18031516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.00%）、三葉豆紫檀苷對(duì)照品（批號(hào)MUST-17060508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.00%）、高麗槐素對(duì)照品（批號(hào)MUST-17060512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.99%），均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)；乙酸銨，二氯甲烷為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；純水和超純水均由Fusion超純水一體機(jī)制備。

WKH-1.7-A 熱風(fēng)循環(huán)烘箱，青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ME204E 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Fusion超純水一體機(jī)，瑞泰純水有限公司；DE-400g 高速多功能粉碎機(jī)，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀，配置SIL-20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A5R 脫氣機(jī)、LC-20AT 四元泵、CTO-20AC 柱溫箱、SPD-M20A 光電二極管陣列紫外可見光檢測(cè)器，日本京都株式會(huì)社島津制作所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品的制備

山豆根剔除多余的雜物和葉片，切成小塊后放入烘箱中在60 ℃條件烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過50 目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。精密稱取0.5 g 山豆根粉末于錐形瓶中，加入一定體積和濃度的二氯甲烷-40%氨水混合液，密塞，稱定質(zhì)量，于超聲波提取器中，按設(shè)定的提取功率、提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)束后稱定重量，補(bǔ)重?fù)u勻，抽濾，濾液置入蒸發(fā)皿，通風(fēng)揮干，將適量分析純甲醇加到殘?jiān)腥芙?，?0 mL 容量瓶稀釋至刻度并搖勻，用規(guī)格為0.45 μm 的微孔濾膜取得供試品溶液，濾液置于樣品瓶中，備用。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷及高麗槐素對(duì)照品（干燥至恒重）2.40 mg、6.00 mg、2.30 mg、2.30 mg 和2.90 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入純甲醇，稀釋至刻度并搖勻，制得金雀花堿（0.096 mg/mL）、氧化苦參堿（0.240 mg/mL）、苦參堿（0.092 mg/mL）、三葉豆紫檀苷（0.092 mg/mL）和高麗槐素（0.116 mg/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱為AQ-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.01 mol/L 醋酸銨溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? ～15 min，10%A；25 min，15%A；35 min，35%A；45 min，50%A；55 min，55%A；70 min，55%A。流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，柱溫30 ℃。

1.2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“1.2.2”項(xiàng)下配制的金雀花堿、三葉豆紫檀苷、苦參堿、高麗槐素、氧化苦參堿混合對(duì)照品溶液，按照2 μL、5 μL、8 μL、10 μL 和15 μL的條件注入高效液相色譜儀，以“1.2.3”色譜條件測(cè)定其峰面積。

1.2.5 精密度考察

精密吸取“1.2.2”混合對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定5 個(gè)色譜峰的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.6 重復(fù)性考察

精密稱取6 份“2.7”項(xiàng)正交試驗(yàn)1 制備的樣品，按照“1.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積，計(jì)算5 個(gè)色譜峰的RSD值。

1.2.7 穩(wěn)定性考察

取“1.2.6”項(xiàng)重復(fù)性試驗(yàn)1 號(hào)供試品溶液，于室溫放置0 h、2 h、4 h、6 h、12 h 和24 h，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定5 個(gè)峰的峰面積，計(jì)算5個(gè)色譜峰的RSD值。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取6 份已知濃度的供試品5 mL，按“2.7”項(xiàng)下正交試驗(yàn)1 制備，置于25 mL 容量瓶中，分別按供試品溶液成分含量的100%加入混合對(duì)照品溶液5 mL，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，以“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

1.2.9 含量測(cè)定

按“1.2.1”制備供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷和高麗槐素5 個(gè)色譜峰進(jìn)行分析。

1.2.10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)單因素考察結(jié)果，確定以二氯甲烷-40%氨水體積比、料液比、提取功率、提取時(shí)間4個(gè)考察因素，每個(gè)因素各取3 個(gè)水平（見表1），以金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷、高麗槐素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）4 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)山豆根有效活性成分的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相指紋圖譜

山豆根供試液按照“1.2.3”條件進(jìn)樣分析，金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷、高麗槐素色譜峰分離度好，各峰之間分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）與供試品溶液（B）的HPLC 圖

2.2 線性關(guān)系考察

以對(duì)照混合液各單體濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積值A(chǔ)為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。

表2 混合液各單體的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 精密度考察

5 個(gè)指標(biāo)成分精密度考察，峰面積RSD值為1.25%～1.98%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

5 個(gè)指標(biāo)成分重復(fù)性考察，峰面積RSD值為1.45%～2.05%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

5 個(gè)指標(biāo)成分穩(wěn)定性考察峰面積RSD值為1.43%～2.18%，表明樣品穩(wěn)定性良好，供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

金雀花堿平均加樣回收率為99.82%，RSD值為1.63%；氧化苦參堿平均加樣回收率為98.78%，RSD值為2.15%；苦參堿平均加樣回收率為99.56%，RSD值為1.87%；三葉豆紫檀苷平均加樣回收率為99.34%，RSD值為1.93%；高麗槐素平均加樣回收率為99.23%，RSD值為2.18%。

2.7 正交試驗(yàn)

2.7.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各正交試驗(yàn)所得的樣本5 個(gè)指標(biāo)性成分的含量，計(jì)算各指標(biāo)成分的提取量，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

2.7.2 基于信息熵賦權(quán)的正交試驗(yàn)分析

計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵（Hi）：Hi=[0.976 0.977 0.899 0.960 0.991]。

計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)（Wi）：Wi=[0.122 0.117 0.513 0.203 0.046]。

綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3+P4m×W4+P5m×W5，即金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷和高麗槐素各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)依次為0.122、0.117、0.513、0.203 和0.046。

經(jīng)過對(duì)山豆根的指標(biāo)含量的計(jì)算，按照公式和步驟，建立以金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷和高麗槐素為原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣，原始評(píng)價(jià)矩陣（X）為：

計(jì)算Pij，將初始矩陣轉(zhuǎn)化為“概率”矩陣（P）：

2.7.3 正交試驗(yàn)方差分析

通過引入信息熵加權(quán)法處理分析正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)，總結(jié)得出影響山豆根有效活性成分得率的因素大小順序?yàn)镈 ＞B ＞C ＞A，對(duì)山豆根提取影響最大的是料液比，提取功率的影響最小。經(jīng)過綜合分析可知，最優(yōu)提取條件為A2B3C1D1，即二氯甲烷-40%氨水體積比25 ∶1.5，料液比1 ∶40，提取功率是90 W，提取時(shí)間是20 min 。

表4 方差分析

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照最佳工藝條件提取山豆根有效活性成分，平行5 份進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得提 取物中各指標(biāo)成分含量，該結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明此工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究通過以二氯甲烷-氨水混合液為提取劑，以金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷和高麗槐素提取率作為指標(biāo)考察，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究超聲波提取法提取山豆根有效活性成分的工藝條件，篩選出最佳的提取工藝條件。得出影響超聲波提取的主次為料液比＞二氯甲烷∶40%氨水體積比＞提取時(shí)間＞提取功率。綜合考慮5 個(gè)指標(biāo)的含量及其提取率的評(píng)價(jià)，優(yōu)選出的最佳提取工藝為二氯甲烷-40%氨水體積比25 ∶1.5，料液比1 ∶40，提取功率90 W，提取時(shí)間20 min。方法學(xué)考察表明，該提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，適合山豆根有效活性成分的提取[11]。

山豆根是一種較為常見的傳統(tǒng)中藥材，屬于我國(guó)三級(jí)瀕危保護(hù)植物，一般在秋季采挖。山豆根主要用于治療咽喉腫痛、口舌生瘡、濕熱黃疸、蚊蟲咬傷所致紅腫熱痛等病癥。本實(shí)驗(yàn)以信息熵賦權(quán)法計(jì)算金雀花堿、氧化苦參堿、苦參堿、三葉豆紫檀苷和高麗槐素的權(quán)重系數(shù)，科學(xué)處理各指標(biāo)對(duì)工藝影響的權(quán)重，從而使山豆根指標(biāo)成分獲得較高的提取率。