楊國(guó)偉，王樹翠，楊樹林

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院，山東泰安 271016）

茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌，多寄生在松科植物樹根上[1]。茯苓中，多糖含量約為80%，其具有降血糖、抗腫瘤、消炎和增強(qiáng)免疫力等藥理功效[2]，是發(fā)揮免疫作用的主要物質(zhì)，能夠提高非特異性免疫系統(tǒng)功能，增強(qiáng)小鼠的抗原特異性體液免疫反應(yīng)[3]，顯著增強(qiáng)小鼠腹腔內(nèi)吞噬細(xì)胞活性，提高NK 細(xì)胞的自然殺傷能力[4]，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法對(duì)茯苓多糖進(jìn)行提取[6]，并以茯苓多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，以4 ～5 周的小鼠為研究對(duì)象，以胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺細(xì)胞凋亡率為指標(biāo)，反映茯苓多糖對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響；并對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行糞便細(xì)菌的微生物分類測(cè)序與分析，以分析茯苓多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的影響是否與腸道菌群相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司的4 ～5 周SPF 級(jí)昆明雌鼠，平均體重為30 g；安徽省亳州市的破壁茯苓粉；分析純無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

AP-01P 真空抽濾機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；R E-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；BKQ-Z30 高壓蒸汽滅菌器，濟(jì)南巴艾貝斯生物工程有限公司；BCD-215WTPM（E）冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；BX53F 熒光顯微鏡，奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茯苓多糖水溶液的制備

采用水提醇沉法制備茯苓多糖，方法為：稱取一定量的茯苓粉末，按照茯苓與水的重量比1 ∶20，85 ℃水浴加熱4 h，采用抽濾機(jī)和孔徑為0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾，收集到的濾液濃縮至原體積的1/10，醇沉濃度為80%，靜置12 h，過濾獲得濾餅后，用80%乙醇洗滌干燥后稱重；用去離子水配制成20 mg/mL 茯苓多糖水溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 小鼠的分組與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組9 只和空白組9 只，實(shí)驗(yàn)組按照20 mg/mL 茯苓多糖水溶液0.02 mL/g 的計(jì)量灌胃，對(duì)照組以相同計(jì)量的生理鹽水灌胃，分別灌胃14 d，其他條件相同且適宜。

1.3.3 體重與糞便采集

用分析天平分別給小鼠稱重并做好記錄；無菌采集小鼠糞便并保存。

1.3.4 胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)計(jì)算

將處死的小鼠胸腺和脾臟取出，稱量并記錄臟器重量，胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)的計(jì)算公式為：

1.3.5 凋亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

將臟器分別置40 g/L 多聚甲醛固定；水洗；逐級(jí)酒精脫水；二甲苯透明，處理30 min；石蠟包埋，3 h；切片，片厚5 ～7 μm；每例標(biāo)本均取兩張切片，并熒光染色計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.3.6 收集糞便并做細(xì)菌的微生物分類測(cè)序分析

對(duì)小鼠糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rDNA 基因測(cè)序分析。測(cè)序部分由上海生工科技有限公司執(zhí)行，主要測(cè)序過程如下。①樣品的預(yù)處理：取1 張膜將樣品剪碎，與裂解液混合，釋放DNA。②提取DNA：使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒提取DNA，并采用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 完整性。③第一輪PCR 擴(kuò)增：利用Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。④第二輪PCR 擴(kuò)增：引入Illumina 橋式PCR 兼容引物，PCR 結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。⑤DNA 純化回收：對(duì)于細(xì)菌和古菌擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp 以上的PCR 產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理。⑥定量混合：利用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA 精確定量，按照1 ∶1 的比例等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA 量取10 ng，最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。⑦上機(jī)測(cè)序：第二代測(cè)序方法檢測(cè)16S rDNA 序列，并通過軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺凋亡細(xì)胞數(shù)采用T-test 分析；腸道菌群豐度多組間比較采用Welch's T-test 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖的提取

經(jīng)水提醇沉法提取，每100g 茯苓粉末可獲得茯苓粗制多糖0.39 g，多糖整體得率為0.39%。

2.2 小鼠胸腺指數(shù)

小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)見表1，以T-test 方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，胸腺指數(shù)p=0.02 ＜0.05，脾臟指數(shù)p=0.93 ＞0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胸腺指數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)表

2.3 小鼠胸腺凋亡細(xì)胞數(shù)

在熒光顯微鏡400 倍視野下隨機(jī)選取6 個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（見圖1），計(jì)算所有視野凋亡細(xì)胞數(shù)（見表2）。以T-test 方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p=0.001 ＜0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胸腺凋亡細(xì)胞數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 小鼠胸腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)表

圖1 熒光染色凋亡細(xì)胞

2.4 小鼠糞便細(xì)菌16S rDNA 微生物分類測(cè)序

2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本（T6、T8、T9、C4、C5、C6）進(jìn)行16S rDNA 微生物分類測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到533 069 條優(yōu)化序列，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別得到263 055 條優(yōu)化序列和270 014 條優(yōu)化序列，見表3。實(shí)驗(yàn)組平均長(zhǎng)度為424.09 bp，對(duì)照組平均長(zhǎng)度為424.57 bp。

表3 各樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4.2 OTU 聚類分析

根據(jù)不同相似水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元）劃分，97%相似水平下的生物信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2 所示。兩組總共有411個(gè)OTU，兩組所共有的OTU為367個(gè)，占總數(shù)的89.2%；實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有19 個(gè)OTU，對(duì)照組獨(dú)有25 個(gè)OTU；實(shí)驗(yàn)組共有386 個(gè)OTU，對(duì)照組共有392個(gè)OTU。由韋恩圖可知，對(duì)照組的OTU 個(gè)數(shù)比實(shí)驗(yàn)組略多，即對(duì)照組的多樣性略大。

圖2 物種分布韋恩圖

2.4.3 群落結(jié)構(gòu)差異分析

STAMP 差異分析用于比較兩組樣本之間物種或功能的豐度，通過此分析可獲得顯著性差異物種或功能以及該物種或功能更趨向何種環(huán)境條件下的樣本。兩組間差異采用Welch's T-test，分析結(jié)果顯示在已明確分類的細(xì)菌中，各級(jí)分類層面組間菌群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值均大于0.05。目（Order）層面上的T-test試驗(yàn)的部分結(jié)果如圖3 和表4。

圖3 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組間Welch's T-test 分析

表4 目（Order）層面上差異性較大的菌屬T 檢驗(yàn)表

3 討論

胸腺和脾臟指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[7]，本研究通過胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)反應(yīng)茯苓多糖對(duì)小鼠機(jī)體免疫的影響。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺指數(shù)均顯著降低（p=0.02），凋亡細(xì)胞數(shù)組間差異顯著（p=0.001），茯苓多糖可以顯著影響小鼠的免疫系統(tǒng)；而兩組小鼠脾臟指數(shù)差異不顯著（p=0.93），說明茯苓多糖對(duì)小鼠脾臟的影響甚微。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對(duì)腸道SIgA 分泌具有調(diào)節(jié)作用[8-9]。含有茯苓多糖成分的四君子湯總多糖口服給藥可對(duì)抗磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜相關(guān)淋巴組織損傷，提示多糖可能對(duì)腸道黏膜免疫具有改善作用[10]。OTU 聚類分析中，大多菌群為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組共有，但對(duì)照組OTU 總數(shù)略多于實(shí)驗(yàn)組，表明對(duì)照組種群多樣性略大于實(shí)驗(yàn)組。對(duì)菌群物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及Welch's T-test 分析可知，門、綱、目、科、屬5 級(jí)別中，兩組小鼠腸道菌群并無明顯差異（p＞0.05），未發(fā)現(xiàn)小鼠免疫系統(tǒng)通過腸道菌群的調(diào)整而受影響的證據(jù)。

4 結(jié)論

茯苓多糖會(huì)顯著影響小鼠胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程，但并未發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響與腸道菌群相關(guān)的證據(jù)。