楊國偉，王樹翠，楊樹林

（山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）公共衛(wèi)生與健康管理學院，山東泰安 271016）

茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌，多寄生在松科植物樹根上[1]。茯苓中，多糖含量約為80%，其具有降血糖、抗腫瘤、消炎和增強免疫力等藥理功效[2]，是發(fā)揮免疫作用的主要物質，能夠提高非特異性免疫系統(tǒng)功能，增強小鼠的抗原特異性體液免疫反應[3]，顯著增強小鼠腹腔內(nèi)吞噬細胞活性，提高NK 細胞的自然殺傷能力[4]，同時對正常細胞無毒副作用[5]。

本實驗采用水提醇沉法對茯苓多糖進行提取[6]，并以茯苓多糖作為免疫調節(jié)劑，以4 ～5 周的小鼠為研究對象，以胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺細胞凋亡率為指標，反映茯苓多糖對小鼠免疫系統(tǒng)的影響；并對實驗組和對照組小鼠進行糞便細菌的微生物分類測序與分析，以分析茯苓多糖對免疫系統(tǒng)的影響是否與腸道菌群相關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

濟南朋悅實驗動物繁育有限公司的4 ～5 周SPF 級昆明雌鼠，平均體重為30 g；安徽省亳州市的破壁茯苓粉；分析純無水乙醇。

1.2 儀器與設備

AP-01P 真空抽濾機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；R E-52A 型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；BKQ-Z30 高壓蒸汽滅菌器，濟南巴艾貝斯生物工程有限公司；BCD-215WTPM（E）冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；BX53F 熒光顯微鏡，奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茯苓多糖水溶液的制備

采用水提醇沉法制備茯苓多糖，方法為：稱取一定量的茯苓粉末，按照茯苓與水的重量比1 ∶20，85 ℃水浴加熱4 h，采用抽濾機和孔徑為0.22 μm的濾膜進行過濾，收集到的濾液濃縮至原體積的1/10，醇沉濃度為80%，靜置12 h，過濾獲得濾餅后，用80%乙醇洗滌干燥后稱重；用去離子水配制成20 mg/mL 茯苓多糖水溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 小鼠的分組與動物實驗

按隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為實驗組9 只和空白組9 只，實驗組按照20 mg/mL 茯苓多糖水溶液0.02 mL/g 的計量灌胃，對照組以相同計量的生理鹽水灌胃，分別灌胃14 d，其他條件相同且適宜。

1.3.3 體重與糞便采集

用分析天平分別給小鼠稱重并做好記錄；無菌采集小鼠糞便并保存。

1.3.4 胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)計算

將處死的小鼠胸腺和脾臟取出，稱量并記錄臟器重量，胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)的計算公式為：

1.3.5 凋亡細胞統(tǒng)計

將臟器分別置40 g/L 多聚甲醛固定；水洗；逐級酒精脫水；二甲苯透明，處理30 min；石蠟包埋，3 h；切片，片厚5 ～7 μm；每例標本均取兩張切片，并熒光染色計數(shù)凋亡細胞。

1.3.6 收集糞便并做細菌的微生物分類測序分析

對小鼠糞便標本進行16S rDNA 基因測序分析。測序部分由上海生工科技有限公司執(zhí)行，主要測序過程如下。①樣品的預處理：取1 張膜將樣品剪碎，與裂解液混合，釋放DNA。②提取DNA：使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒提取DNA，并采用瓊脂糖凝膠檢測DNA 完整性。③第一輪PCR 擴增：利用Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應應加入的DNA量。④第二輪PCR 擴增：引入Illumina 橋式PCR 兼容引物，PCR 結束后，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測。⑤DNA 純化回收：對于細菌和古菌擴增的PCR 產(chǎn)物和正常擴增片段在400 bp 以上的PCR 產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理。⑥定量混合：利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對回收的DNA 精確定量，按照1 ∶1 的比例等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA 量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。⑦上機測序：第二代測序方法檢測16S rDNA 序列，并通過軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺凋亡細胞數(shù)采用T-test 分析；腸道菌群豐度多組間比較采用Welch's T-test 分析。

2 結果與分析

2.1 茯苓多糖的提取

經(jīng)水提醇沉法提取，每100g 茯苓粉末可獲得茯苓粗制多糖0.39 g，多糖整體得率為0.39%。

2.2 小鼠胸腺指數(shù)

小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)見表1，以T-test 方法進行統(tǒng)計分析，胸腺指數(shù)p=0.02 ＜0.05，脾臟指數(shù)p=0.93 ＞0.05，實驗組與對照組胸腺指數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義。

表1 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)表

2.3 小鼠胸腺凋亡細胞數(shù)

在熒光顯微鏡400 倍視野下隨機選取6 個視野計數(shù)凋亡細胞（見圖1），計算所有視野凋亡細胞數(shù)（見表2）。以T-test 方法進行統(tǒng)計分析，p=0.001 ＜0.05，實驗組與對照組胸腺凋亡細胞數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義。

表2 小鼠胸腺細胞凋亡細胞數(shù)表

圖1 熒光染色凋亡細胞

2.4 小鼠糞便細菌16S rDNA 微生物分類測序

2.4.1 測序數(shù)據(jù)

通過對實驗組和對照組樣本（T6、T8、T9、C4、C5、C6）進行16S rDNA 微生物分類測序、數(shù)據(jù)質控后，共得到533 069 條優(yōu)化序列，實驗組、對照組分別得到263 055 條優(yōu)化序列和270 014 條優(yōu)化序列，見表3。實驗組平均長度為424.09 bp，對照組平均長度為424.57 bp。

表3 各樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.4.2 OTU 聚類分析

根據(jù)不同相似水平，對所有序列進行OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元）劃分，97%相似水平下的生物信息統(tǒng)計結果如圖2 所示。兩組總共有411個OTU，兩組所共有的OTU為367個，占總數(shù)的89.2%；實驗組獨有19 個OTU，對照組獨有25 個OTU；實驗組共有386 個OTU，對照組共有392個OTU。由韋恩圖可知，對照組的OTU 個數(shù)比實驗組略多，即對照組的多樣性略大。

圖2 物種分布韋恩圖

2.4.3 群落結構差異分析

STAMP 差異分析用于比較兩組樣本之間物種或功能的豐度，通過此分析可獲得顯著性差異物種或功能以及該物種或功能更趨向何種環(huán)境條件下的樣本。兩組間差異采用Welch's T-test，分析結果顯示在已明確分類的細菌中，各級分類層面組間菌群差異無統(tǒng)計學差異，P值均大于0.05。目（Order）層面上的T-test試驗的部分結果如圖3 和表4。

圖3 實驗組、對照組兩組間Welch's T-test 分析

表4 目（Order）層面上差異性較大的菌屬T 檢驗表

3 討論

胸腺和脾臟指數(shù)是衡量機體免疫功能的重要指標[7]，本研究通過胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和凋亡細胞數(shù)反應茯苓多糖對小鼠機體免疫的影響。結果表明，實驗組小鼠的胸腺指數(shù)均顯著降低（p=0.02），凋亡細胞數(shù)組間差異顯著（p=0.001），茯苓多糖可以顯著影響小鼠的免疫系統(tǒng)；而兩組小鼠脾臟指數(shù)差異不顯著（p=0.93），說明茯苓多糖對小鼠脾臟的影響甚微。

相關研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對腸道SIgA 分泌具有調節(jié)作用[8-9]。含有茯苓多糖成分的四君子湯總多糖口服給藥可對抗磷酰胺誘導的小鼠腸黏膜相關淋巴組織損傷，提示多糖可能對腸道黏膜免疫具有改善作用[10]。OTU 聚類分析中，大多菌群為實驗組、對照組兩組共有，但對照組OTU 總數(shù)略多于實驗組，表明對照組種群多樣性略大于實驗組。對菌群物種豐度進行統(tǒng)計以及Welch's T-test 分析可知，門、綱、目、科、屬5 級別中，兩組小鼠腸道菌群并無明顯差異（p＞0.05），未發(fā)現(xiàn)小鼠免疫系統(tǒng)通過腸道菌群的調整而受影響的證據(jù)。

4 結論

茯苓多糖會顯著影響小鼠胸腺細胞的發(fā)育過程，但并未發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對小鼠免疫系統(tǒng)的影響與腸道菌群相關的證據(jù)。