楊宇

（潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

黑米營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)、賴(lài)氨酸、脂肪含量分別為10%～13%、0.4%～0.6%、2%～5%，富含P、Ca、Se、Mo、Mn、Cu、Zn 和Fe 等礦物質(zhì)元素及VB1、VB2、VB6、VB12、VE、VD 和 煙 酸 等 維 生 素，尤其富含普通米缺乏的胡蘿卜素和VC[1]。黑米及黑米皮中花色苷是重要的生物活性物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力[2-4]，在偏酸性環(huán)境下隨著溶液pH 降低，穩(wěn)定性增加，溶液濃度對(duì)穩(wěn)定性影響較小[5]。對(duì)黑米的研究和應(yīng)用不斷深入，與市場(chǎng)上受歡迎的乳酸菌飲料和益生菌產(chǎn)品結(jié)合可以研制營(yíng)養(yǎng)保健、口感清爽、風(fēng)味獨(dú)特的活性乳酸菌飲料。

近年出現(xiàn)了許多關(guān)于植物乳桿菌等益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群的產(chǎn)品和功能研究[6-10]，及以黑米為原料制作飲料的研究[11-12]。參考國(guó)際市場(chǎng)上的養(yǎng)樂(lè)多等活性乳酸菌飲料，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐中遇到的問(wèn)題和需求，本文圍繞發(fā)酵型黑米飲料的關(guān)鍵工藝和發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行試驗(yàn)及分析，通過(guò)正交試驗(yàn)確定活菌型黑米飲料的配方，以期為黑米和益生菌資源高效利用及其乳酸飲料的研發(fā)與生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米、白砂糖，購(gòu)于永輝超市；直投式發(fā)酵劑（植物乳桿菌Lp-G18、嗜酸乳桿菌Lp-G80）200 U/包，潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司；中溫α-淀粉酶（酶活3 750 U/g），天野酶制劑（江蘇）有限公司；復(fù)配增稠穩(wěn)定劑（結(jié)冷膠、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、麥芽糊精），荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)；檸檬酸，濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司，乳酸，河南金丹乳酸科技有限公司；MRSA 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 型電子天平、BSA822 型pH 計(jì)、MYP19150型電動(dòng)攪拌器、G20 型全自動(dòng)滴定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；博勒飛DV-II+Pro 數(shù)顯粘度計(jì)，天津市布魯克科技有限公司；FA25 型間歇式高剪切機(jī)，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；LDZX-50KBS 型滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-W600型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；APV-1000 型高壓均質(zhì)機(jī)，上海順儀科技有限公司；CB 800V 型超凈工作臺(tái)，蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

復(fù)合益生菌黑米飲料的工藝流程為：黑米→蒸煮→打漿→高剪切→酶解→定容→均質(zhì)→滅酶→冷卻→接種→發(fā)酵→檢測(cè)→加入滅菌的糖和穩(wěn)定劑溶液→定容→調(diào)配→檢驗(yàn)→均質(zhì)→灌裝→冷藏。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 確定黑米用量

對(duì)原料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，按黑米蛋白含量7.8%、脂肪含量1.6%、碳水化合物73.8%計(jì)算。本文均按質(zhì)量計(jì)，配制蛋白質(zhì)含量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的黑米漿，30 U/kg 淀粉酶65 ℃水解30 min，按工藝流程制成發(fā)酵黑米濃漿，檢測(cè)發(fā)酵后感官和發(fā)酵液pH。

1.3.2.2 酶處理黑米漿

蛋白含量2.0%的米漿分別在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃和80 ℃下，30 U/kg 淀粉酶水解黑米漿30 min，檢測(cè)粘度、pH，確定最適溫度；在該溫度下分別添加20 U/kg、30 U/kg、40 U/kg、50 U/kg 和60 U/kg 的淀粉酶，檢測(cè)粘度確定淀粉酶合適添加量。

1.3.2.3 發(fā)酵時(shí)間

接種直投發(fā)酵劑，（38±1）℃恒溫發(fā)酵4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 和28 h，確定最適發(fā)酵時(shí)間，檢測(cè)活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 活菌計(jì)數(shù)

按照GB 4789.35—2016，平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

使用pH 計(jì)測(cè)定pH，粘度的測(cè)定選用2 號(hào)轉(zhuǎn)子，60 r/min，冷卻至25 ℃檢測(cè)1 min。

1.3.3.3 感官評(píng)價(jià)方法

邀請(qǐng)20 位品嘗者，按照表1 對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分。

表1 黑米發(fā)酵樣品的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 正交試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

4 因素3 水平正交試驗(yàn)，確定活菌飲料中米漿、白砂糖、復(fù)配增稠穩(wěn)定劑用量和pH 值4 個(gè)因素的最優(yōu)水平，使用Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 黑米漿濃度對(duì)發(fā)酵速度的影響

發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致體系pH 降低，發(fā)酵越快，pH 降低越快，產(chǎn)酸越多pH 越低。如圖1和表2 所示，米漿中蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH 下降有明顯影響，蛋白質(zhì)含量0.5%及以下時(shí)由于含有的氨基酸、肽和糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)較少，發(fā)酵速度慢；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量達(dá)到2.5%時(shí)，濃稠米漿不利于菌種分散均勻和生長(zhǎng)，發(fā)酵速度并沒(méi)有優(yōu)于2.0%，且米漿口感過(guò)于稠厚，顏色為黑紫色，優(yōu)選蛋白含量2.0%的黑米漿用于發(fā)酵。

圖1 蛋白質(zhì)含量對(duì)發(fā)酵速度的影響

表2 蛋白質(zhì)含量對(duì)酸度的影響

2.1.2 酶處理的溫度和酶用量對(duì)發(fā)酵的影響

α-淀粉酶從淀粉（直鏈和支鏈）、糖原和環(huán)糊精分子的內(nèi)部水解α-1,4 糖苷鍵，能顯著降低淀粉食品的粘度，越過(guò)α-1,6 糖苷鍵繼續(xù)催化淀粉水解，主要產(chǎn)物是α-葡萄糖、α-麥芽糖和很小的糊精分子[13-14]，為乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸提供碳源。固定酶處理時(shí)間為30 min，通過(guò)測(cè)定料液粘度和38 ℃、20 h發(fā)酵的pH，可知該型號(hào)中溫α-淀粉酶對(duì)米漿中淀粉的最適合酶解溫度為70 ℃，而且水解充分時(shí)發(fā)酵米漿的pH 更低，如圖2 所示。

圖2 溫度對(duì)酶解效果的影響

酶解30 min 條件下，隨酶用量增大，米漿粘度逐漸下降，但50 U/kg 以上時(shí)由于粘度過(guò)低，在殺菌后出現(xiàn)了分層和沉淀，所以用40 U/kg 淀粉酶適度水解米漿中的部分淀粉，如圖3 所示。

圖3 酶用量對(duì)酶解效果的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的適宜生長(zhǎng)溫度在38 ℃左右[15-18]，設(shè)定（38±1）℃恒溫發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)8 ～16 h 發(fā)酵pH 下降最快，24 h 以后pH 幾乎不再降低?；罹鷶?shù)在發(fā)酵開(kāi)始0 ～4 h 處于延滯期，產(chǎn)生的有機(jī)酸很少，米漿沒(méi)有酸感。4 ～16 h 乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，快速生長(zhǎng)后受有機(jī)酸抑制，這期間米漿的pH 下降速度較快。20 h 后進(jìn)入乳酸菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，pH 下降緩慢，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH 和活菌數(shù)的影響

酸感和發(fā)酵風(fēng)味會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而更加濃郁，24 h 發(fā)酵感官評(píng)分最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)風(fēng)味會(huì)更豐富，但酸感更加強(qiáng)烈，如圖5 所示。綜合以上，確定24 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以活菌型乳酸菌飲料為參考，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析如表3 和表4 所示。結(jié)果表明，對(duì)飲料感官評(píng)分影響最大的是高酯果膠用量，其次是白砂糖，試驗(yàn)最佳組合為A2B3C2D2。經(jīng)驗(yàn)證，30%發(fā)酵黑米漿與滅菌后的糖漿混合，飲料白砂糖含量11%，高酯果膠用量為0.40%，用檸檬酸等酸味劑調(diào)pH 至3.8 時(shí)飲料穩(wěn)定性和口感都很受歡迎，4 ～6 ℃貯藏30 d，活菌數(shù)大于1.0×108CFU/mL。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3 結(jié)論

黑米具有低蛋白質(zhì)、高碳水化合物的特點(diǎn)，其中較高含量的淀粉使米漿非常黏稠，給實(shí)際生產(chǎn)加工帶來(lái)不便。所以發(fā)酵型產(chǎn)品的關(guān)鍵點(diǎn)是將米漿中的淀粉部分分解[19]，便于富集米漿碳源和氮源，使直投式發(fā)酵劑能在低粘度米漿中分散并獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本文所選中溫α-淀粉酶需在40 U/kg 濃度下，70 ℃左右水解蛋白質(zhì)含量2.0%的黑米漿30 min，經(jīng)過(guò)均質(zhì)、滅酶、冷卻至（38±1）℃，接種由植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌組成的發(fā)酵劑，恒溫發(fā)酵24 h，至pH 3.7 ～3.8，形成發(fā)酵黑米漿。由于黑米中的花色苷在酸性條件下顯紅色，發(fā)酵過(guò)程中黑米漿逐漸由深紫色轉(zhuǎn)為靚麗的紫紅色，未酶解的淀粉糊化使體系有一定的粘度，沒(méi)有明顯的分層或析水現(xiàn)象。

通過(guò)4 因素3 水平正交試驗(yàn)，可確定飲料含發(fā)酵黑米漿30%、11%白砂糖、高酯果膠0.40%，用檸檬酸等酸味劑調(diào)pH 至3.8 時(shí)，口感清爽且酸甜適當(dāng)，顏色靚麗，有淡淡的米香味和發(fā)酵特有的風(fēng)味，感官上最受歡迎。該活菌黑米飲料在4 ～6 ℃貯藏30 d，活菌數(shù)大于1.0×108CFU/mL。