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        NB-UVB對黑素細胞黑素合成相關基因表達的影響

        2021-09-02 07:54:00孫晶瑩霍雪萍孫麗君
        中國麻風皮膚病雜志 2021年10期
        關鍵詞:劑量檢測

        孫晶瑩 封 青 李 研 霍雪萍 孫麗君

        陜西省人民醫(yī)院中心實驗室,陜西西安,710068

        白癜風是皮膚黑素脫失后白斑為主要表現(xiàn)的皮膚性疾病,目前該疾病發(fā)病機制尚不明確,但該疾病和人體自身免疫力及遺傳因素有一定關系[1,2]。導致白癜風的主要原因是人體黑素細胞遭到破壞,細胞中黑素顆粒不斷減少,進而引起皮膚斑片狀色素脫失。近年來的研究表明,窄譜中波紫外線(narrow bound ultraviolet B light, NB-UVB)在臨床上治療白癜風具有較好療效,其可促進黑素細胞黑素的合成和增加酪氨酸酶活性,從而有效緩解白癜風癥狀[3-5],但其具體機制仍不清楚。

        本研究使用上海西格瑪公司生產(chǎn)的SS型紫外線光療儀,波長為311~313 nm,該波段的紫外線光毒性小,色素恢復較一致,色差小,療效好。用此光療儀作用黑素細胞,研究不同劑量的紫外線照射對黑素細胞的細胞活性、黑素含量以及黑素合成相關基因表達的影響,探討NB-UVB對黑素合成的影響及在白癜風復色中的可能機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗材料 人來源的傳代穩(wěn)定的黑素細胞系PIG1,由芝加哥洛約拉大學Caroline Le Poole教授惠贈。黑素細胞基礎培養(yǎng)基Medium 254及培養(yǎng)基添加劑HMGS-2 均購自Gibco公司; 胎牛血清購于Hyclone 公司; RNA 提取試劑盒購自AG公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT reagent kit、熒光PCR酶SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit均購自TaKaRa公司,引物由上海生工合成; Tyr、Tyrp2、GPNMB、MART-1抗體均購于Abcam公司,Syntenin抗體購自proteintech,β-actin、HRP羊抗鼠、HRP羊抗兔購于康為試劑,NC膜購自Pall Corporation公司。

        1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱購于Heraeus公司; 核酸測定儀Nanodrop2000c和冷凍高速離心機均購于Thermo Scientific公司;倒置熒光顯微鏡購于Olympus公司;熒光PCR儀7500 購于ABI公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購于BIO-RAD,凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech,紫外光療儀SS-03B型光療儀(上海希格瑪高技術有限公司,波長311 nm)。

        1.2 方法

        1.2.1 黑素細胞的培養(yǎng) 液氮罐中凍存的PIG1細胞37℃復蘇,待完全融化后1200 rpm離心5 min,在超凈工作臺中棄掉凍存液上清,將細胞重懸于含8%胎牛血清及HMGS-2因子的M254培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2條件下培養(yǎng),細胞貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.2 UVB照射 將PIG1細胞按每皿6×105/mL的量接種于直徑35 mm細胞培養(yǎng)皿上,于37℃,5%細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)液,1×PBS洗滌1次,加入少量1×PBS,采用紫外線光療儀以不同的時間照射PIG1細胞,照射時間以及對應的輻照劑量見表1,照射完畢后棄掉PBS,加入2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),設置未照射組用于對照。

        表1 不同照射時間對應的輻照劑量

        1.2.3 MTT法檢測細胞活力的變化 收集對數(shù)生長期細胞,制成細胞懸液,按細胞濃度2×103個/孔接種細胞于96孔板,培養(yǎng)過夜后,分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)不同UVB劑量照射處理細胞,每組設3個復孔,24 h后每孔加入20 μL MTT溶液,37℃孵育4 h;去除上清后每孔加入100 μL DMSO溶解細胞,用酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。

        1.2.4 NaOH裂解法測定黑素含量 根據(jù)1.2.3中篩選的紫外線照射劑量,選擇400、800、1200 mJ/cm2劑量進行照射。黑素含量的測定:UVB相應劑量處理細胞48 h后,0.25%胰酶消化,離心后去上清,PBS清洗兩次,用PBS重懸后細胞計數(shù),每個管中加入200 μL濃度為1M NaOH(含100 g/L的DMSO),80℃水浴鍋作用2 h,利用酶標儀檢測A475的吸光值。

        1.2.5 RT-PCR方法檢測黑素合成相關基因的表達 將處于對數(shù)生長期的黑素細胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜,初始細胞數(shù)為3×105個/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細胞,分別于24 h后收集細胞,采用RNA抽提試劑盒提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA為模板,擴增Tyr、Tyrp1、Tyrp2、OA1、MART-1、Pmel17、VAT-1、OCSP、syntenin、CHCHD3、flotillin-1、GPNMB 12個黑素合成相關基因以及內(nèi)參β-actin基因,計算各個基因的相對表達量。引物由上海生工生物技術公司合成,序列見表2。

        表2 引物序列表

        1.2.6 Western blot方法檢測黑素合成相關蛋白的表達 將處于對數(shù)生長期的黑素細胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜,初始細胞數(shù)為3×105個/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細胞,于48 h后收集細胞,細胞裂解液(含RIPA)提取蛋白,BCA法測蛋白濃度,加入2×上樣緩沖液混合加熱變性,進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳完成后,將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至NC膜上,200 mA 2 h濕轉(zhuǎn),5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h,4℃搖床振蕩過夜孵育一抗,PBST洗3次,5 min/次,室溫孵育二抗45 min,PBST洗3次,5 min/次,凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的條帶。

        1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 紫外線照射不同劑量對細胞活性的影響 培養(yǎng)黑素細胞,分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)的不同UVB照射劑量處理細胞,24 h后MTT檢測細胞活力的變化。結(jié)果顯示400、800和1200 mJ/cm2三組照射劑量對細胞活力影響不大,可以作為后續(xù)實驗的選擇,而輻射強度>1200 mJ/cm2時,細胞活性明顯下降(圖1)。

        圖1 紫外線照射不同劑量對細胞活性的影響

        2.2 紫外線照射對黑素合成的影響 分別選擇400、800、1200 mJ/cm2三個不同的紫外照射劑量處理PIGI細胞,48 h后檢測不同處理組的黑素含量,結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加,黑素含量增加,與對照組相比,800、1200 mJ/cm2照射劑量的細胞黑素含量明顯升高,表明紫外線照射增加了黑素合成(圖2)。

        2.3 紫外線照射對黑素合成相關基因的影響 選擇UVB劑量1200 mJ/cm2處理黑素細胞,24 h后收細胞,RT-PCR檢測12種黑素合成相關基因的表達。結(jié)果顯示,紫外線照射后,tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這五種基因的表達顯著升高,有顯著差異(P<0.05),見圖3。

        (*表示與對照組相比,P<0.05)

        圖3 紫外線照射對黑素合成相關基因表達的影響(*P<0.05) 圖4 紫外線照射對黑素合成相關蛋白表達的影響

        2.4 紫外線照射對黑素合成相關蛋白的影響 根據(jù)2.3的RT-PCR檢測結(jié)果, western blot檢測tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB蛋白的表達情況,結(jié)果顯示,紫外線照射48 h后,tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

        3 討論

        黑素細胞是位于表皮基底層(皮膚的最外層)的特化細胞[6],其新陳代謝是一個精確調(diào)控的生物學行為,受到外環(huán)境(紫外線等)和內(nèi)環(huán)境(細胞間相互作用等)的共同影響[7]。黑素的合成在黑素細胞內(nèi)進行,黑素細胞上有光受體,紫外線照射能引起黑素細胞的黑素合成,因此當皮膚受到紫外線照射或體內(nèi)激素發(fā)生變化時,局部皮膚黑素細胞產(chǎn)生的黑素量增加,從而在皮膚上發(fā)生色素沉著。

        目前已知有12種蛋白質(zhì)被認為是黑素體特異性蛋白,分別是Tyr(tyrosinase)、Tyrp1(tyrosinase-related protein 1)、Tyrp2(tyrosinase-related protein 2)、OA1(ocular albinism type 1 protein)、MART-1、gp100/Pmel17、VAT-1(vesicle amine transport protein 1 homolog)、OCSP(oculospanin)、syntenin、FLJ20420或稱CHCHD3、flotillin-1/2和GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b)[8]。這些黑素體特異蛋白按照其特性及功能大致可以分為三大類:酶組分、結(jié)構(gòu)組分和未知組分。Tyr、Tyrp1和Tyrp2是黑素形成中具有關鍵作用的酶組分,其在黑素合成中的功能已較為清楚,而在黑素體結(jié)構(gòu)蛋白中,Pmel17是迄今為止唯一被證明參與黑素體中纖維狀結(jié)構(gòu)形成的蛋白[9]。GPNMB也是一種黑素小體特異性結(jié)構(gòu)蛋白,它與Pmel17/gp100在結(jié)構(gòu)上高度相似,在各個時期的黑素小體中都有表達[10,11]。

        本研究以這12種黑素體蛋白為檢測對象,明確紫外線照射對這12種黑素體蛋白表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫外線照射細胞后,RT-PCR方法檢測到Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這5種蛋白的基因表達明顯升高,western blot檢測結(jié)果進一步證實了Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達升高。Tyr、Tyrp2被UVB上調(diào)的結(jié)果已經(jīng)在很多既往研究里面被證實[12];另外張萍研究發(fā)現(xiàn)GPNMB也可以被UVB上調(diào)[13];syntenin和MART-1被上調(diào)的現(xiàn)象在我們的研究中首次被報道。同時我們發(fā)現(xiàn)GPNMB和Pmel17雖同為黑素體的結(jié)構(gòu)蛋白且氨基酸序列高度同源,UVB照射極大的促進GPNMB基因的表達,但是對Pmel17基因的影響并不明顯,分析原因可能是由于Pmel17的PKD結(jié)構(gòu)域和 RPT結(jié)構(gòu)域的獨特性導致UVB對兩者產(chǎn)生不同的變化。MART-1蛋白是黑素體成熟所必需的,Syntenin蛋白對黑素合成的影響在我們之前的研究中也已經(jīng)明確[14],UVB對這兩種蛋白表達的上調(diào)也進一步驗證了其在黑素合成中的重要作用。

        紫外線照射可以造成色素沉著,但是過量的紫外線又會損傷黑素細胞,影響細胞活性。本研究發(fā)現(xiàn)輻射強度>1200 mJ/cm2UVB時,細胞活性明顯下降。本研究為UVB治療白癜風時照射劑量的選擇及白癜風復色的機制探討提供了依據(jù)。

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