魏麗萍 周文文 王皓敏 張士發(fā)

1錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽(yáng)，110016；2大連醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽(yáng)，110016；3東北國(guó)際醫(yī)院皮膚科，遼寧沈陽(yáng)，110623

Paget病(Paget’s disease)又稱(chēng)為濕疹樣癌(eczematoid carcinoma)，是一種少見(jiàn)的皮損表現(xiàn)為濕疹樣外觀的低度惡性表皮內(nèi)腺癌，其組織病理特點(diǎn)是在表皮內(nèi)發(fā)現(xiàn)Paget細(xì)胞，臨床上可分為乳房Paget病(mammary Paget’s disease，MPD)和乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease，EMPD)。Gsk-3β可以調(diào)節(jié)多種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖與凋亡，對(duì)腫瘤的發(fā)生具有雙重調(diào)節(jié)作用。CD82具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。Axin1發(fā)揮抑制腫瘤的功能。目前Gsk-3β、CD82和Axin1已被證明參與乳腺癌、惡性黑素細(xì)胞瘤、皮膚鱗癌等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，但其在MPD和EMPD中的作用國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道，為探究其在MPD和EMPD中的作用，本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表達(dá)情況，分析其相關(guān)性，從而探討它們?cè)贛PD和EMPD發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院皮膚科2007年4月至2019年8月病理診斷為MPD和EMPD患者的蠟塊和病歷資料各20例，并且患者確診前均未行放療或化療治療。另收集本科室就診的良性皮膚病患者的正常皮膚組織蠟塊10例為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Gsk-3β單抗(bs-0028R)、兔抗人CD82單抗(bs-1470R)、兔抗人Axin1單抗(bs-2439R)、免疫組化染色試劑盒(SP-0023)、DAB 試劑盒(CO2-04001)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色 石蠟塊切片(5 μm厚)、烤片、脫蠟、水化，高壓修復(fù)抗原(100×檸檬酸鈉修復(fù)液與蒸餾水按照1∶100稀釋?zhuān)邏哄伾掀笮迯?fù)4 min)，按免疫組化染色試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色(PAP筆在組織片周?chē)?～3 mm畫(huà)一閉合圓圈，滴加3%H2O2，37℃孵育20 min，PBS液洗5 min×3次，滴加試劑A，37℃孵育20 min，傾去，勿洗，滴加1∶500稀釋一抗，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫1 h，PBS液洗5 min×3次，滴加試劑B，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次，滴加試劑C，37℃孵育20 min，PBS 液洗5 min×3次)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。PBS液作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 由我科兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的皮膚病理醫(yī)師采用雙盲法鏡檢閱片，每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，放大400倍觀察評(píng)估。在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈黃色或棕色顆粒狀沉積視為陽(yáng)性染色。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色計(jì)0分，弱染色(淡黃色)計(jì)1分，中度染色(棕黃色)計(jì)2分，強(qiáng)染色(棕褐色)計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。免疫組化評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度積分。0～4分為陰性或低表達(dá)，5～8分為中度表達(dá)，9～12分為高表達(dá)[1]。

2 結(jié)果

2.1 Gsk-3β在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達(dá) 三組間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但MPD與EMPD相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 CD82在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達(dá) 三組間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且MPD與EMPD相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Axin1在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達(dá) 三組間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但MPD與EMPD相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD、EMPD及正常皮膚組織中的表達(dá)

2.4 Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD中表達(dá)的相關(guān)性 Gsk-3β和CD82在MPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.291，P=0.212)，Gsk-3β和Axin1在MPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.236，P=0.316)。CD82和Axin1在MPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.039，P=0.869)。

2.5 Gsk-3β、CD82和Axin1在EMPD中表達(dá)的相關(guān)性 Gsk-3β和CD82在EMPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.261，P=0.266)，Gsk-3β和Axin1在EMPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.392，P=0.088)。CD82和Axin1在EMPD中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.362，P=0.117)。

1a: Gsk-3β在MPD中低表達(dá)；1b: Gsk-3β在EMPD中低表達(dá)；1c: Gsk-3β在正常皮膚組織中中度表達(dá)；1d：CD82在MPD中中度表達(dá)；1e：CD82在EMPD中低表達(dá)；1f：CD82在正常皮膚組織中高表達(dá)；1g：Axin1在MPD中低表達(dá)；1h：Axin1在EMPD中低表達(dá)；1i：Axin1在正常皮膚組織中中度表達(dá)；1a～1i均主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜

3 討論

Gsk-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin、PI3K/PTEN/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等通路，參與細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞過(guò)程[2]。有報(bào)道在近端胃癌患者中，Gsk-3β陽(yáng)性表達(dá)明顯低于胃正常組織，且Gsk-3β陽(yáng)性表達(dá)的降低與胃癌的分期、分化、浸潤(rùn)及淋巴轉(zhuǎn)移呈明顯負(fù)相關(guān)，其在近端胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及淋巴轉(zhuǎn)移等方面起到重要的抑制作用[3]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Gsk-3β過(guò)表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin和mTOR/p70S6K1信號(hào)通路，使HIF-1和VEGF低表達(dá)，抑制了腫瘤的血管生成及生長(zhǎng)，從而抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[4]。在鼻咽癌中，Gsk-3β失活可增加EZH2蛋白的穩(wěn)定，導(dǎo)致EZH2過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤遷移和增強(qiáng)其侵襲能力，從而促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，可能是鼻咽癌治療的未來(lái)潛在靶標(biāo)[5]。本研究首次發(fā)現(xiàn)Gsk-3β在MPD、EMPD中的表達(dá)顯著低于正常皮膚組織，三者表達(dá)強(qiáng)度具有顯著性差異，且MPD與EMPD相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Gsk-3β在MPD、EMPD中的低表達(dá)，與上述相關(guān)研究結(jié)果一致[3-5]，提示Gsk-3β可能通過(guò)同種信號(hào)通路對(duì)乳房和乳房外Paget病的發(fā)生及發(fā)展起抑制作用。Gsk-3β在上述癌癥中的低表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用，因此Gsk-3β可能為腫瘤的診斷、進(jìn)展及治療提供新的作用靶點(diǎn)和思路。

CD82是KAI1編碼的能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞膜糖蛋白，可與其他四跨膜蛋白、非四跨膜蛋白形成四跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮生理功能，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老[6]。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者中，KAI1/CD82陽(yáng)性表達(dá)顯著低于乳腺正常組織，且CD82表達(dá)強(qiáng)度與乳腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等方面有重要的抑制作用[7]。在子宮內(nèi)膜癌患者中，CD82陽(yáng)性表達(dá)顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織，且表達(dá)強(qiáng)度與子宮內(nèi)膜癌的分期、分化、浸潤(rùn)程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯負(fù)相關(guān)，CD82的低表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)異?？蓞f(xié)助判斷腫瘤轉(zhuǎn)移、評(píng)估預(yù)后和指導(dǎo)治療[8]。本研究首次發(fā)現(xiàn)CD82在EMPD中的表達(dá)低于MPD，且兩者顯著低于正常皮膚組織，三組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MPD與EMPD相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD82在MPD和EMPD中的低表達(dá)，與已有研究結(jié)果一致[7，8]，提示CD82可能通過(guò)不同信號(hào)通路對(duì)乳房和乳房外Paget病的發(fā)病過(guò)程起抑制作用。CD82的低表達(dá)或下調(diào)與許多惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，因此CD82可作為預(yù)測(cè)腫瘤患者疾病進(jìn)展及預(yù)后的參考。

Axin1是一種包含多結(jié)構(gòu)域的支架蛋白，可以與多種不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，參與Wnt、p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等多種信號(hào)通路，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是一種腫瘤抑制因子[9]。據(jù)報(bào)道在肝癌組織中，Axin1低表達(dá)與miR-650的高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Axin1的過(guò)表達(dá)顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，而用miR650處理后則消除了Axin1對(duì)腫瘤的抑制能力，因此Axin1和miR-650可以協(xié)助腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后[10]。在肺癌中，野生型Zbed3與Axin結(jié)合，可通過(guò)抑制Axin/TPC/GSK-3β復(fù)合物的降解來(lái)上調(diào)β-catenin表達(dá)和Wnt信號(hào)活性來(lái)促進(jìn)肺癌增殖和侵襲，而在缺少Axin結(jié)合位點(diǎn)的Zbed3突變體中卻未能增強(qiáng)β-catenin的表達(dá)，其過(guò)程依賴(lài)Axin[11]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，Axin1在MPD、EMPD中的表達(dá)顯著低于正常皮膚組織，三者表達(dá)強(qiáng)度具有顯著性差異，且MPD與EMPD相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Axin1在MPD、EMPD中的低表達(dá)，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[10，11]，提示Axin1可能通過(guò)同種信號(hào)通路對(duì)乳房外和乳房Paget病的發(fā)病過(guò)程發(fā)揮抑制作用。Axin1是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的抑制因子，穩(wěn)定或上調(diào)Axin1的表達(dá)可抑制腫瘤的增殖和侵襲，可成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

既往未見(jiàn)Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中表達(dá)相關(guān)性的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，Gsk-3β、CD82和Axin1在MPD和EMPD中的表達(dá)并無(wú)協(xié)同作用，雖然Axin1和Gsk-3β均可通過(guò)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3，9]，而CD82可以減少β-catenin的磷酸化和核內(nèi)聚集，對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有抑制作用[6]，但Gsk-3β還可通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK、Hedgehog、Notch、NF-κB等信號(hào)通路對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響，Axin1也可通過(guò)與Gsk-3β不同的信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤的作用，如p53、TGF-β、PI3K/AKT/mTOR和JNK/SAPK等信號(hào)通路，至于它們的表達(dá)調(diào)控是否有相互作用及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。