孫庭漢，劉美，孫曉

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.體育部；2.藥學(xué)院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

科學(xué)適宜的耐力運(yùn)動(dòng)對慢阻肺、糖尿病等具有較好的保健和治療效果［1-2］。對骨骼肌全基因組表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠顯著上調(diào)三羧酸循環(huán)相關(guān)的基因表達(dá)，說明運(yùn)動(dòng)能夠調(diào)控能量代謝［3］。運(yùn)動(dòng)對身心健康的積極影響已被廣泛研究。目前關(guān)于遺傳信息與體育活動(dòng)相關(guān)性以及運(yùn)動(dòng)影響體內(nèi)分子過程的研究仍然有限。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮核心作用，可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)發(fā)揮多種生物學(xué)功能［4］。機(jī)體內(nèi)的miRNA在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉結(jié)構(gòu)重塑、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等作用中起關(guān)鍵作用［5-6］。不同訓(xùn)練模式可能導(dǎo)致體內(nèi)循環(huán)miRNA發(fā)生改變，由于miRNA在血漿或血清中的穩(wěn)定性，循環(huán)miRNA可以作為一種潛在的生物標(biāo)志物。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析經(jīng)8周耐力運(yùn)動(dòng)前后健康受試者外周血中miRNA的表達(dá)譜變化，預(yù)測差異表達(dá)miRNA作用的靶基因及可能的靶向信號通路，為后續(xù)的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源

本研究從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公 共基因芯片數(shù)據(jù)平臺（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE133910，該研究共納入23例健康且未經(jīng)鍛煉的受試者，其中男13例，女10例，平均年齡（47.9±8.3）歲（范圍為30～63歲），體質(zhì)量為（82.0±13.1）kg，身高為（173.9±7.0）cm。未經(jīng)鍛煉的納入標(biāo)準(zhǔn)為：既往無競技耐力訓(xùn)練，入組前1年每周運(yùn)動(dòng)時(shí)間＜1 h，男性最大攝氧量（maximal oxygen consumption，VO2max）＜ 45 mL/（min·kg），女 性VO2max ＜40 mL/（min·kg）。受試者經(jīng)8周的耐力運(yùn)動(dòng)，每周進(jìn)行4次45 min運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，可以選擇持續(xù)步行或慢跑，通過心率監(jiān)測方式保證整個(gè)運(yùn)動(dòng)過程中，心率儲備（heart rate reserve，HRR）強(qiáng)度保持在70%以上。然后對受試者外周血中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，對照耐力運(yùn)動(dòng)前后外周血中miRNA水平的變化。PAXGene Blood miRNA試劑盒（德國Qiagen公司）分離出包括小RNA在內(nèi)的總RNA。通過采集全血，應(yīng)用PAXGene全血miRNA分離試劑盒（德國凱杰公司）分離出包括小RNA在內(nèi)的總RNA。檢測的基因芯片平臺為GPL25134 Agilent-070156 Human_miRNA_V21.0_Microarray 046064（miRNA ID version），芯片共檢測了2 549個(gè)miRNA。

1.2 差異表達(dá)miRNA篩選

用R語言軟件讀取下載矩陣文件，使用limma包對耐力運(yùn)動(dòng)后和運(yùn)動(dòng)前受試者的外周血miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，得到差異表達(dá)miRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2基因表達(dá)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對值≥1，由于miRNA和靶基因的關(guān)系為一對多，為了降低出現(xiàn)假陽性結(jié)果的概率，在miRNA靶基因篩選時(shí)，以P＜ 0.01作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)。利用R語言ggplot2包繪制耐力運(yùn)動(dòng)前后外周血差異表達(dá)miRNA的火山圖。

1.3 差異miRNA靶基因篩選

miRNA在體內(nèi)主要結(jié)合在靶基因的3’UTR，下調(diào)靶基因的表達(dá)。miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）是用于預(yù)測miRNA靶基因的開源在線分析工具［10］。首先應(yīng)用miRWalk中的外聯(lián)數(shù)據(jù)庫miRDB對耐力運(yùn)動(dòng)前后差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，設(shè)定閾值為0.9，獲得靶基因數(shù)據(jù)集A；再利用DIANA tools中的MicroT-CDS數(shù)據(jù)庫（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/）對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測［11］，獲得靶基因數(shù)據(jù)集B。然后，不同數(shù)據(jù)獲得的差異表達(dá)miRNA靶基因取交集作為差異miRNA的靶基因。利用Cytoscape軟件對篩選的差異表達(dá)miRNA和靶基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.4 差異miRNA靶基因的GO和KEGG分析

本研究通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫［12］在線分析提供所需的基因本體論（gene ontology，GO）生物功能富集數(shù)據(jù)，GO按照生物途徑（biological process，BP）、細(xì)胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）對基因進(jìn)行注釋和分類。除此之外，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析［13］，從而發(fā)現(xiàn)差異miRNA可能參與的生物學(xué)通路。采用EASE Score或Fisher Exact統(tǒng)計(jì)方法，GO和KEGG各項(xiàng)篩選條件為P＜ 0.05。應(yīng)用R語言ggplot2包根據(jù)分析結(jié)果繪制氣泡圖。

1.5 蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

STRING（https：//string-db.org/）網(wǎng)站是用于評估PPI的在線分析工具［14］。將本研究篩選出的所有差異表達(dá)miRNA靶基因?qū)隨TRING（版本11.0）分析工具，探討它們之間可能的相互作用關(guān)系。設(shè)置篩選條件為互作最大值=0，最小互作得分≥ 0.40。通過STRING得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，把STRING的計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape（版本3.7.2）［15］，應(yīng)用Cytoscape插件cyto-Hubba依據(jù)Closeness值大小，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的前10個(gè)基因進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)前后外周血中差異miRNA的篩選

本研究選用基因表達(dá)芯片GSE133910，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，健康受試者經(jīng)8周耐力運(yùn)動(dòng)后，外周血中共篩選出8個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中2個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（FC≥ 2，P＜ 0.01），其中hsamiR-8052、hsa-miR-6889-5p和hsa-miR-4457變化最為明顯，見表1。利用火山圖分析和觀察FC值2倍以上變化的miRNA分布及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中標(biāo)注為灰色的是FC值2倍以下或者P＞ 0.05的基因，表達(dá)下調(diào)的基因標(biāo)注為藍(lán)色，表達(dá)上調(diào)的基因標(biāo)注為紅色，見圖1。

表1 耐力運(yùn)動(dòng)后外周血差異表達(dá)的miRNA分析Tab.1 Analysis of miRNA differentially expressed in peripheral blood after endurance exercise

圖1 8周耐力運(yùn)動(dòng)后血中miRNA表達(dá)變化火山圖Fig.1 Volcano plot profiling miRNA differential expression in human peripheral blood between trained and untrained groups

2.2 差異miRNA靶基因的篩選

分別通過miRWalk及microT-CDS數(shù)據(jù)庫篩選出差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行分析（圖2），由miRWalk數(shù)據(jù)庫篩選出靶基因1 424個(gè)，由microT-CDS數(shù)據(jù)庫篩選出靶基因1 030個(gè)。利用R語言的VennDiagram包對2組數(shù)據(jù)進(jìn)行韋恩圖分析，可見2個(gè)數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測的靶基因個(gè)數(shù)為251個(gè)。韋恩圖結(jié)果顯示（圖2），可差異miRNA有較多共同的靶基因。將miRNA及其調(diào)控的靶基因，通過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，見圖3。

圖2 miRWalk和microT-CDS數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA靶基因的韋恩圖Fig.2 Venn diagram demonstrating the overlap between target genes of differentially expressed miRNA predicted with the miRWalk and microT-CDS databases

圖3 差異miRNA靶基因及通路互作圖Fig.3 Visualization of interactions between differentially expressed miRNAs and their corresponding target genes

2.3 差異miRNA靶基因GO和KEGG富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG信號通路富集分析，見圖4。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)miRNA靶基因主要參與離子通道結(jié)合、突觸后致密蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合、mRNA結(jié)合等分子功能；BP主要涉及外在凋亡通路、GTP酶激活、同種細(xì)胞黏附、抑制RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子等；CC在質(zhì)膜、核膜等部位。KEGG通路分析結(jié)果顯示，miRNA靶基因主要與多個(gè)腫瘤信號通路、谷氨酸能突觸、Wnt信號通路、甘油磷脂代謝通路等有關(guān)。

圖4 差異表達(dá)miRNA靶基因GO和KEGG通路富集分析Fig.4 GO and KEGG pathway enrichment analysis of differential miRNA target genes

2.4 差異表達(dá)miRNA靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將251個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因?qū)隨TRING進(jìn)行分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由251個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白和285條相互作用關(guān)系構(gòu)成（PPI enrichmentP=1.29×10-4）。將STRING分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，利用插件cytoHubba對候選miRNA靶基因的closeness篩選出的前十個(gè)關(guān)鍵基因分別為PRKACA、SMURF1、RHOA、GNAO1、CBL、UBE2D2、GSK3B、GNAQ、BCL2L1和RRAS2（圖5），關(guān)鍵基因用黃色、橙色、紅色標(biāo)注，顏色越深表明該基因在網(wǎng)絡(luò)中的作用越為重要。篩選出的關(guān)鍵基因主要分布在能量代謝平衡、細(xì)胞增殖等通路。

圖5 CytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的基因Fig.5 The top 10 hub genes in the PPI network selected by cytoHubba

3 討論

miRNA是機(jī)體內(nèi)廣泛分布的一類小RNA，主要通過誘導(dǎo)mRNA的降解或干擾蛋白質(zhì)的翻譯過程，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。耐力運(yùn)動(dòng)能夠通過調(diào)控相關(guān)miRNA的表達(dá)，有效提高機(jī)體肌肉的強(qiáng)度，增強(qiáng)心血管功能，同時(shí)對改善呼吸、血液、能量代謝等功能具有積極影響［7］。

在本研究中，通過對經(jīng)8周耐力運(yùn)動(dòng)后的健康受試者外周血miRNA水平進(jìn)行檢測，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)miRNA（FC≥2，P＜ 0.01），分別是miR-8052、miR-6835-5p、miR-6881-5p、miR-6889-5p、miR-6766-5p、miR-4278、miR-4457和miR-1297。其中，研究［8］發(fā)現(xiàn)miR-6835的表達(dá)與血管內(nèi)皮的炎癥和脂滴形成有關(guān)，脂聯(lián)素受體1（adiponectin receptor 1，AdipoR1）被證明是miR-6835-5p的直接靶基因，而miR-6835-5p通過抑制AdipoR1的表達(dá)可刺激胰島素的分泌，對于2型糖尿病可能是一種有效的治療方法［9］。在耐力運(yùn)動(dòng)后，健康受試者外周血的miR-6835-5p的表達(dá)顯著升高，從而抑制AdipoR1的表達(dá)，從而影響糖類和脂肪的代謝過程，進(jìn)而影響機(jī)體的能量代謝［10］。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)miR-6881的表達(dá)與人脂肪干細(xì)胞的成骨分化有關(guān)，血清miR-1297可作為蛛網(wǎng)膜下腔出血及多種腫瘤的生物標(biāo)志物，并可能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

通過數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示共有251個(gè)靶基因可能受到差異miRNA的靶向作用。本研究富集的KEGG信號通路及通路中富集的基因?yàn)楹罄m(xù)運(yùn)動(dòng)對腫瘤作用機(jī)制的研究提供一定的參考。KEGG通路還涉及細(xì)胞增殖、能量代謝（GTP酶激活通路）和脂質(zhì)代謝通路等。1項(xiàng)對健康老年人肌肉的全基因組分析研究［13］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)耐力運(yùn)動(dòng)后與能量代謝、物質(zhì)代謝、肌肉質(zhì)量、肌肉收縮、肌肉成分信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和亞鐵血紅素的生物合成等相關(guān)基因表達(dá)改變。

此外，本研究經(jīng)cytoHubba篩選出的關(guān)鍵基因中PRKACA（cAMP依賴性蛋白激酶A催化亞基α）能夠調(diào)節(jié)多種蛋白的翻譯表達(dá)，包括離子通道蛋白、轉(zhuǎn)錄激活蛋白和糖原代謝調(diào)節(jié)酶的表達(dá)［14］。SMURF1與多種重要的生物學(xué)途徑相關(guān)，包括骨生成途徑、非經(jīng)典的Wnt途徑和促分裂原活化的蛋白激酶途徑等，并且研究［15］發(fā)現(xiàn)SMURF1在骨骼形成和腫瘤細(xì)胞侵襲方面與年齡和生理狀態(tài)有關(guān)。GSK3B除能夠調(diào)控糖原合成酶的活性外，還能作用于眾多信號蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子［16］。通過本研究結(jié)果及查閱相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合既往研究，猜測耐力運(yùn)動(dòng)可能通過miR-6835-5p/PRKACA通路調(diào)控機(jī)體的能量代謝平衡，通過miR-6766-5p/SMURF1通路促進(jìn)骨骼生長，或通過miR-6881-5p/GSK3B通路調(diào)控糖代謝等。本課題由于未進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證，具有一定的局限性，后續(xù)將開展進(jìn)一步的機(jī)制研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)顯著影響外周血miRNA的表達(dá)水平，差異表達(dá)的miRNA可能通過腫瘤、能量代謝、糖代謝、骨生成等通路介導(dǎo)耐力運(yùn)動(dòng)對機(jī)體的生物學(xué)作用，通過綜合多平臺數(shù)據(jù)庫分析能夠有效預(yù)測相關(guān)靶蛋白富集的生物功能和通路，為進(jìn)一步研究耐力運(yùn)動(dòng)對體內(nèi)分子過程影響提供參考。