孫海燕 楊 靖 趙元增

（河南科技學(xué)院 新鄉(xiāng)453003）

丹參（Salvia miltiorrhiza）又名赤參、紫丹參、紅根等，是唇形科多年生草本植物，以根及根莖入藥，是我國傳統(tǒng)的中藥材，在治療心血管疾病、抗癌、抗衰老方面具有良好效果[1]。丹參的活性成分為脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類兩大類化合物，被制成片劑、注射劑等；通過化學(xué)方法提取的有效成分丹參素、原兒茶醛和丹酚酸制成的用于冠心病、心絞痛預(yù)防和治療的復(fù)方丹參滴丸[1-3]，在1997年就通過美國FDA的新藥臨床研究審評，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。近些年來，作為醫(yī)藥工業(yè)的重要原料，丹參藥材的消耗量日益增大，野生丹參資源已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求。因此丹參的人工種植和栽培越來越受到重視，丹參的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程不斷加快[2]。研究實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，在丹參的種植過程中使用傳統(tǒng)的根段進(jìn)行繁殖，長期的營養(yǎng)繁殖容易使病毒病傳播導(dǎo)致丹參品質(zhì)退化，培養(yǎng)出來的丹參品質(zhì)良莠不齊，難以滿足生產(chǎn)需要[4-5]；丹參蘆頭繁殖，出苗時間緩慢，一般需要60～75 d，如遇不良?xì)夂蛞蛩?，會出現(xiàn)爛根，出苗率一般只有10%～15%[6]。因此，為能在短期內(nèi)獲得大量的健壯丹參種苗，本試驗(yàn)從2019年11月開始到2020年11月結(jié)束，歷時1年時間，以丹參種子為材料，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了丹參的快速繁殖體系，包括丹參種子引發(fā)處理、無菌體系建立、丹參增殖培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基篩選。同時利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行分析，完善了丹參組培快繁技術(shù)體系，為大批量生產(chǎn)丹參優(yōu)質(zhì)種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丹參種子由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 丹參種子的引發(fā)處理

挑選籽粒飽滿的丹參種子放入紗布袋中用自來水沖洗干凈，之后用12.5 mg/L的6-BA溶液在25℃恒溫培養(yǎng)箱中浸種2 h[7]。

1.3 丹參無菌體系的建立

1.3.1 丹參種子表面滅菌 在超凈工作臺中將經(jīng)過6-BA溶液引發(fā)處理的丹參種子（在紗布袋內(nèi)）用適量75%酒精初步滅菌30 s，倒掉酒精加入0.1%HgCl2溶液滅菌7 min，之后倒掉HgCl2溶液，用無菌水沖洗4次，每次1～2 min，以確保完全沖洗掉種子表面殘留的HgC12溶液。

1.3.2 丹參種子的接種與培養(yǎng) ①無菌接種：在超凈工作臺中將表面滅菌后的丹參種子接種于盛有1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種10顆種子并使種子均勻分散至培養(yǎng)基中。②培養(yǎng)：將接種好的丹參種子置于培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上，光照度1 000～2 000 lx、光照時間12 h、溫度25℃條件下培養(yǎng)17 d。

1.3.3 丹參無菌苗擴(kuò)繁 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的激素，不同處理見表1。將“1.3.2”中接種17 d后萌發(fā)的丹參種子的幼芽，分別接種到不同處理的培養(yǎng)基中，每瓶接種3棵幼苗，并使其均勻分散至培養(yǎng)基中，在瓶壁外標(biāo)記好不同處理和接種日期。將接種好的丹參幼苗置于培養(yǎng)室，溫度25℃、光照度2 000～3 000 lx條件下培養(yǎng)30 d，以獲得大量無菌苗，建立丹參苗無菌體系[8]。

表1 丹參無菌苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基不同激素濃度配比處理

1.4 丹參增殖培養(yǎng)基的篩選

為優(yōu)化丹參苗的快速增殖方法，以初步擴(kuò)繁的丹參無菌苗為試驗(yàn)材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過添加NAA和6-BA并設(shè)置不同濃度配比，不同處理見表2。

表2 丹參增殖培養(yǎng)基處理分組

截取丹參無菌幼苗頂芽，分別接種到上述不同處理的培養(yǎng)基上，每個處理接種15瓶，每瓶接種3棵。將接種好的丹參幼苗置于培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件同“1.3.3”，培養(yǎng)30 d，每天觀察丹參無菌苗的生長情況。30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)量，并計(jì)算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=總苗數(shù)/接種苗數(shù)。

結(jié)果觀察：統(tǒng)計(jì)丹參無菌苗葉片生長狀態(tài)、增殖芽的數(shù)量及形態(tài)等性狀。

1.5 丹參生根壯苗培養(yǎng)基的篩選

以“MS+蔗糖（3%）+瓊脂（0.44%），pH 5.8”培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過添加NAA和IBA 2種激素，進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。不同試驗(yàn)處理設(shè)置見表3。

表3 丹參生根壯苗培養(yǎng)基不同激素處理

選取長勢整齊一致的丹參無菌苗分別接種到上述不同處理的培養(yǎng)基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種3棵。將接種后的丹參幼苗置于培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件同“1.3.3”，并每天觀察丹參無菌苗的生長情況，于20 d后統(tǒng)計(jì)根數(shù)、株高及根粗，并計(jì)算生根率。生根率=生根苗數(shù)/總苗數(shù)。

結(jié)果觀察：用刻度尺測量丹參無菌苗的株高和根長，統(tǒng)計(jì)丹參無菌苗的枯葉數(shù)、葉片的狀態(tài)、根的狀態(tài)等性狀。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

通過Excel和SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長激素種類及配比對丹參增殖的影響

在不同NAA和6-BA濃度配比的MS培養(yǎng)基上，丹參增殖與生長狀況見表4。

由表4可知，各增殖培養(yǎng)基處理與對照相比，其增殖系數(shù)均大于對照處理，且添加細(xì)胞分裂素6-BA的各處理（除處理1外）均與對照有顯著差異；單添加生長素NAA的2個處理與對照的增殖系數(shù)相比沒有顯著差異性。說明細(xì)胞分裂素6-BA在促進(jìn)丹參幼苗增殖中起到了良好的增殖效應(yīng)。

表4 不同NAA/6-BA濃度配比對丹參增殖的影響

處理1、處理2和處理3各培養(yǎng)基配方中，均添加了相同低濃度的NAA（0.02 mg/L），6-BA的添加濃度依次遞增，增殖率均有所提高，這3個處理間沒有顯著差異，但處理2和處理3與對照均有顯著差異；處理4、處理5和處理6各培養(yǎng)基配方中，在處理1～處理3的基礎(chǔ)上，提高了生長素NAA（0.04 mg/L）的濃度，處理5的增殖系數(shù)為所有處理中最高；此結(jié)果說明適當(dāng)?shù)腘AA/6-BA濃度配比能顯著提高丹參的增殖率。但隨著2種激素的共同添加，處理1～處理6中各丹參幼苗均表現(xiàn)出不同程度的玻璃化現(xiàn)象。但在處理8～處理10中，添加了相應(yīng)濃度的6-BA，均未添加NAA，幼苗幾乎沒有玻璃化現(xiàn)象，說明NAA的添加對丹參增殖有促進(jìn)作用的同時也易導(dǎo)致丹參幼苗玻璃化。

處理8～處理10培養(yǎng)基中只添加了6-BA，6-BA的濃度依次增加，其增殖率較對照相比均有提高，且處理8～處理10培養(yǎng)基中丹參的增殖系數(shù)與對照有顯著差異性；處理11～處理12培養(yǎng)基中只添加了NAA，沒有顯著提高丹參苗的增殖率。處理8～處理12丹參幼苗在培養(yǎng)過程中基本沒有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)。

玻璃化對后期組培幼苗的生長影響較大，且造成的損害基本是不可逆的。在本試驗(yàn)的各處理中，處理5的增殖系數(shù)最大，但增殖幼苗出現(xiàn)了較嚴(yán)重的玻璃化，且芽和葉片非常小，呈簇生狀，不利于后期培養(yǎng)；同時，增殖系數(shù)較高的處理3、處理2和處理6也有不同程度的玻璃化現(xiàn)象，因此不選為增殖的最佳培養(yǎng)基。

綜合各種因素，本試驗(yàn)選出MS+6-BA（0.2 mg/L）（處理8）為丹參幼苗增殖的最佳培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基中，丹參幼苗增殖系數(shù)大，沒有玻璃化現(xiàn)象，幼苗葉片大，枯葉少，幼苗整體生長健壯。

2.2 不同植物激素種類及濃度對丹參生根壯苗的影響

NAA和IBA都是植物組織培養(yǎng)中常用的植物生長激素，它們能夠促進(jìn)植物根的分化，但促進(jìn)植物生根的效果常因植物種類的不同而存在差異。在不同NAA和IBA濃度的各培養(yǎng)基上，丹參生根壯苗狀況見表5。

表5 不同激素種類及濃度對丹參生根壯苗的影響

在所有處理的培養(yǎng)基中，丹參的生根率均較高，但不同處理生根數(shù)量及根的粗細(xì)明顯不同。說明丹參幼苗容易生根，但要獲得大量粗壯的根需添加適合的生長素進(jìn)行調(diào)節(jié)，以更好促進(jìn)根的分化。

添加NAA各處理中丹參生根狀況均比添加IBA處理的生根狀況好，此結(jié)果表明，在促進(jìn)丹參根的分化中，NAA的作用要優(yōu)于IBA；在添加NAA的各處理中丹參株高的增長也比只添加IBA的處理效果好。

在添加NAA的各培養(yǎng)基中，MS+NAA（0.01 mg/L）（處理2）生根率不高，根數(shù)量較多，但根多為很細(xì)的須狀根；MS+NAA（0.02 mg/L）（處理3）生根率最高，誘導(dǎo)出根的數(shù)量較多且最粗壯，根長也比較適中，整體植株長勢最好；MS+NAA（0.05 mg/L）（處理4）和MS+NAA（0.2 mg/L）（處理5）根的數(shù)量較少。 此結(jié)果表明，培養(yǎng)基中低濃度的NAA促進(jìn)根的分化和生長，高濃度的NAA添加則不利于根的生長。

添加0.02 mg/L NAA的培養(yǎng)基中生根率和根的數(shù)量均優(yōu)于其他處理，且在此培養(yǎng)基中根生長得最粗壯且根長適中，整體植株長勢最好，為丹參生根壯苗的最佳培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以丹參種子為材料，通過升汞溶液表面滅菌，種子無菌接種及引發(fā)劑誘導(dǎo)萌發(fā)等試驗(yàn)環(huán)節(jié)，獲得了一定量的丹參無菌幼苗，為下一步的丹參無菌快繁體系建立準(zhǔn)備了充足的試驗(yàn)材料；通過不同NAA和6-BA濃度配比的培養(yǎng)基設(shè)置，篩選出最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.2 mg/L）+蔗糖（3%）+瓊脂（0.44%），pH 5.8，在此培養(yǎng)基中，丹參無菌幼苗增殖系數(shù)高，葉片較大，顏色嫩綠且無枯葉，整體增殖和生長狀況好；在丹參無菌幼苗增殖的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了生根壯苗培養(yǎng)，分別在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA和IBA，發(fā)現(xiàn)NAA對丹參幼苗生根壯苗效果較好，篩選出最佳生根壯苗培養(yǎng)基為MS+NAA（0.02 mg/L）+蔗糖（3%）+瓊脂（0.44%），pH 5.8，在此培養(yǎng)基中，丹參幼苗的生根率和根的數(shù)量較多，且根生長粗壯，植株生長良好，有利于后期的大田移栽。

丹參幼苗在增殖的過程中，要選用適當(dāng)激素種類及合適濃度配比的培養(yǎng)基；如果用激素濃度較高的培養(yǎng)基，尤其是添加了生長素NAA培養(yǎng)基，容易引發(fā)幼苗玻璃化；6-BA濃度高，增殖率高，但生成的幼苗較小，葉片小，呈簇生狀，無效苗較多，不利于后期培養(yǎng)。在本研究中最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.2 mg/L）+蔗糖（3%）+瓊脂（0.44%），pH=5.8，這與解曉紅等的“在MS+6-BA（1.0 mg／L）+NAA（0.5 mg/L）的培養(yǎng)基中使丹參無菌苗的頂芽增殖出大量的不定芽[5]”研究結(jié)論有差異，分析原因可能與在試驗(yàn)中采用不同品種的丹參材料有關(guān)[7]。

孟倩等以丹參的葉片為外植體、以不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對丹參根誘導(dǎo)進(jìn)行的試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，1/2MS+NAA（0.5 mg/L）的培養(yǎng)基配方為誘導(dǎo)丹參無菌苗生根的最適培養(yǎng)基配方[8]。在本研究中丹參無菌苗生根壯苗效果最好的培養(yǎng)基配方為MS+NAA（0.02 mg/L）。與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論有差異，但相同之處都是NAA這一植物激素對丹參無菌苗的生根誘導(dǎo)效果最佳，只是濃度上的差異。分析原因可能與在試驗(yàn)中采用不同品種的丹參材料有關(guān)，也可能是因?yàn)檫x用的基本培養(yǎng)基不同所致[7]。