嚴 婷，李 霞，3，4，5，曹 悅，吳博晗，王 凈，張嫚嫚

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014；3.江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；4.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；5.南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

干旱脅迫是所有的非生物脅迫中最復(fù)雜，并且是全球規(guī)模的脅迫，對水稻產(chǎn)量及質(zhì)量造成嚴重威脅[1]。由于C4作物在高溫、強光以及干旱等條件下，較C3作物具有明顯的生長優(yōu)勢、水分以及營養(yǎng)利用效率，生物學(xué)產(chǎn)量也較高[2]，因此，科學(xué)家利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將玉米等C4植物中C4光合途徑關(guān)鍵基因?qū)隒3植物中，達到增強光合效率和提高產(chǎn)量的目的[3]。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31)是C4光合途徑的關(guān)鍵酶[4]，已發(fā)現(xiàn)，高表達的轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻在高光強[5]、高溫[6]、干旱[7]和低氮[8]等逆境條件下表現(xiàn)出高光合效率和高產(chǎn)量的特性，因此，提高水稻的C4光合特性將是提高水稻抵御非逆境的有效策略之一[9]。

表觀遺傳機制調(diào)控植物應(yīng)答外界脅迫是近年來發(fā)現(xiàn)的重要機制之一，其中DNA甲基化是表觀遺傳的重要形式之一，在調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)基因表達和植物脅迫耐受中也起重要作用[10]。植物DNA甲基化機制又是非常復(fù)雜的，因物種、基因型、組織以及作用元件而異，但是很多研究都來自擬南芥的研究成果[11]。實際上，水稻基因組具有復(fù)雜性質(zhì)，其不連續(xù)的異染色質(zhì)和廣泛分布的DNA甲基化也為了解植物DNA甲基化研究提供了更豐富的資源[12]。已繪制了水稻秈粳亞種在基因表達、生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)中的DNA甲基化圖譜[13]。前人研究表明，高表達轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC水稻植株的外源導(dǎo)入基因C4-PEPC啟動子在干旱條件下也存在甲基化現(xiàn)象，而且通過C4-PEPC的去甲基化，上調(diào)C4-PEPC的表達和其酶活性，共同參與了轉(zhuǎn)基因水稻植株對干旱的早期響應(yīng)[7]，提示DNA甲基化可能也是水稻響應(yīng)干旱的機制之一。為此，本研究以高表達轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)為材料，通過施用不同濃度的DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-azaC)，研究不同生育期DNA甲基化在水稻響應(yīng)干旱中影響，并研究聚乙二醇模擬的干旱條件下，分析DNA甲基化在水稻干旱響應(yīng)的品種差異機制，為豐富水稻干旱響應(yīng)機制提供信息。

1 材料和方法

1.1 種植

本試驗使用的材料最初來源于Ku等[14]將玉米C4-PEPC基因?qū)肴毡揪綤itaake，C4-PEPC基因在野生型中獲得高表達，獲得的T2轉(zhuǎn)基因材料，并經(jīng)過江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院光合生理實驗室在南京的18代穩(wěn)定培養(yǎng)選育所得的轉(zhuǎn)基因水稻(PC)以及未轉(zhuǎn)基因原種水稻Kitaake(WT)。盆栽試驗于2018年5-9月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所水稻示范基地網(wǎng)室中進行。5月2日，將水稻種子使用75%的乙醇浸泡5 min，隨后使用50%次氯酸鈉浸泡15 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，保證無消毒液殘留，消毒后使用蒸餾水浸種，置于30 ℃黑暗條件下泡種3 d，待種子露白，放在濕潤的培養(yǎng)皿中催芽，當(dāng)種子長出約0.5 cm的芽后，選取生長一致的材料，于5月10日播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院網(wǎng)室中，常規(guī)水肥和病蟲害管理。

1.2 水稻發(fā)芽率試驗

將消毒的水稻種子分組，試驗包括對照組( 清水發(fā)芽培養(yǎng))，以下簡稱處理A，模擬干旱組(10% 聚乙二醇6000 ，10% Polyethylene glycol 6000，簡稱10% PEG，處理B)以及5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-azaC)聯(lián)合模擬干旱組(5-azaC+10% PEG)，5-azaC (A2385)購自Sigma公司。芽期5-azaC 聯(lián)合模擬干旱組設(shè)置7 個處理濃度，分別為C：2.5 μmol/L+10% PEG、D：5.0 μmol/L+10% PEG、E：7.5 μmol/L+10% PEG、F： 10.0 μmol/L+10% PEG、G：30.0 μmol/L+10% PEG、H： 50.0 μmol/L+10% PEG和I：100.0 μmol/L+10% PEG。每個處理重復(fù)3 次，每次100 粒，試驗材料培養(yǎng)4 d，每天記錄發(fā)芽率(發(fā)芽率=當(dāng)天內(nèi)總發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%)。

1.3 水培試驗處理

消毒的水稻種子浸種催芽，待長出約0.5 cm的芽后，將種子按間隔插入黑色的水稻培養(yǎng)板上培養(yǎng)，在長出第2片葉子之前均用清水培養(yǎng)，水稻長到2葉期時，將幼苗轉(zhuǎn)移到用國際水稻所(International Rice Research Institute)標(biāo)準營養(yǎng)液中，置于 30 ℃/25 ℃ (晝/夜)、14 h/10 h(光/暗)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。待水稻長到 5～6 葉期后，選擇株型、長勢和葉片均一的植株作為試驗材料，將材料分組，以國際標(biāo)準營養(yǎng)液作為對照，藥劑處理采用根吸入法，在處理前一天，將植株移入含不同濃度5-azaC的營養(yǎng)液，暗中預(yù)處理12 h，次日再用光下適應(yīng)2 h，之后將植株轉(zhuǎn)移到含有10%(m/V) PEG-6000的培養(yǎng)液中(以下稱模擬干旱脅迫，Drought stress，DS)，在光下處理2 h 后。之后取下倒二葉，迅速在-80 ℃液氮中保存，用于測定各項生理指標(biāo)，同時測定處理前后相對含水量(Relative water content，RWC)，在苗期并以RWC 作為耐旱性指標(biāo)。

1.4 盆栽試驗處理

盆栽里裝的土為稻田黏壤土，每1種處理的PC和WT分別種植9盆，盆缽提前做好隨機區(qū)組分布，將發(fā)芽的水稻種植在盆缽中，日常水肥和病蟲管理。待水稻幼苗長至4～5葉期時，挑選長勢均一的幼苗移栽至僅施加了基肥(即復(fù)合肥，含15%的N，15%的P，15%的K)的盆中，每盆栽5穴，每穴栽1株，盆栽試驗所用的器皿均為底部直徑25 cm，高25 cm的陶瓷盆缽。盆栽試驗總施氮量為300 kg/hm2，分別以基肥(35% N)、分蘗肥(20% N)和穗肥(45% N)等按時期施加，移栽后所施加的氮肥均為尿素。隨機分成2組，一組正常灌溉(對照，CK)，一組自然干旱(Drought stress，DS)。其中自然干旱處理在水稻孕穗期對試驗組PC和WT停止正常澆灌，進行自然干旱處理，將盆缽排水自然落干，頂部用透明薄膜覆蓋防雨水，自然干旱組又隨機分為3組，另外2組為5-azaC聯(lián)合干旱組，其中5-azaC設(shè)置了2個濃度，分別為50，100 μmol/L，該處理每5 d分別噴施2種濃度5-azaC溶液1次，共處理5次，每株共噴施50 mL溶液(DS+5-azaC)；單獨自然干旱組則噴施同樣體積的清水(以下稱干旱脅迫，DS)。5 次處理結(jié)束后，所有處理均恢復(fù)正常灌溉，開花后50 d 收獲，考察產(chǎn)量及其構(gòu)成因子。

1.5 光合參數(shù)的測定

不同處理的盆栽水稻植株在開花后7～14 d測定劍葉的光合參數(shù)，方法參照Li等[16]的方法，使用美國LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400款便攜式光合測定儀，選擇晴天無云的8：30-11：30室外條件下進行測定，葉片光合參數(shù)測定的條件：使用紅藍光源測定，光量子通量密度(PPFD，Photosynthetic photon flux density) 800 μmol/(m2·s)，流速500 μmol/s，待CO2和H2O開始穩(wěn)定后開始測量。測定供試材料的凈光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal coductence，Gs)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration，Ci)和蒸騰速率(Transpiration rate，Tr)，通過WUE=Pn/Tr，計算出水分利用率(Water use efficiency，WUE)。通過CE=Pn/Ci，計算出羧化效率(Carboxylation efficiency，CE)。每個處理測定5張葉片，每個處理5次重復(fù)。

1.6 相對含水量的測定

植株的水分狀態(tài)通過植株相對含水量(Relative water content，RWC)的測定決定[17]。試驗包括對照組(清水處理，處理A)、模擬干旱組(10% PEG，處理B)以及5-azaC聯(lián)合模擬干旱組(5-azaC+10% PEG)，苗期5-azaC聯(lián)合模擬干旱組設(shè)置9個處理濃度，分別為C：2.5 μmol/L+10% PEG、D：5.0 μmol/L+10% PEG、E：7.5 μmol/L+10% PEG、F：10.0 μmol/L+10% PEG、G：30.0 μmol/L+10% PEG、H：50.0 μmol/L+10% PEG、I：100.0 μmol/L+10% PEG、J：250.0 μmol/L+10% PEG和K：500.0 μmol/L+10% PEG。植株在光下處理2 h后，剪取第4葉中間6 cm部分，測其鮮質(zhì)量(Fresh weight，F(xiàn)W)，然后將葉切片在室溫下漂浮在去離子水中6 h，測定其飽和水質(zhì)量(Turgid weight ，TW)，隨后在105 ℃烘箱中殺青15 min，70 ℃的烘箱中干燥過夜至恒質(zhì)量，再稱質(zhì)量以獲得干質(zhì)量(Drought weight，DW)。RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%[17]，每個處理測定5 張葉片，每個處理5個重復(fù)。

1.7 丙二醛含量的測定

根據(jù)Velikova等[18]方法，測定樣品中丙二醛含量。

1.8 可溶性蛋白和脯氨酸含量的測定

參照考馬斯亮藍G-250法[19]測定苗期葉片的可溶性蛋白含量，脯氨酸含量參考Troll等[20]方法測定。

1.9 可溶性糖和各糖組分含量的測定

樣品中可溶性總糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量參照Ambavaram等[21]的方法進行。

1.10 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定參考唐玉婷等[8]的方法。

1.11 總RNA提取和qRT-PCR

總RNA 的提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 根據(jù)等報道的方法制備總RNA和反轉(zhuǎn)錄[5]。在PCR 儀(ETC811，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)上進行。根據(jù)制造商的說明書使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒(TaKaRa Biotechnology(大連)有限公司)進行qRT-PCR 分析，用Applied Biosystems Step One 實時PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)分析。qRT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s 和68 ℃ 各 1 min，共32 次循環(huán)。重復(fù)3 次。在Primer 3 上設(shè)計引物，以水稻組成性表達的Actin基因為內(nèi)部參照，引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.12 產(chǎn)量構(gòu)成因子的測定

在植株開花后50 d，收獲植株，在收獲取樣時各個處理取長勢和穗數(shù)平均值相近的10株測定其產(chǎn)量構(gòu)成因子，收獲后自然風(fēng)干，當(dāng)籽粒含水量≤14.5%后，再進行室內(nèi)考種。測定每株株高、穗數(shù)、穗長、穗實粒數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量以及單株產(chǎn)量。

1.13 統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行描述和作圖，P<0.05。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)的基因引物Tab.1 Gene primes for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度5-azaC對水稻發(fā)芽率的影響

從表2可見，在模擬干旱條件下，小于30.0 μmol/L的5-azaC處理均促進水稻快速萌動，而且在培養(yǎng)第4天具有較高的發(fā)芽率，而大于G處理(5-azaC濃度為30.0 μmol/L)緩解干旱抑制的效果不顯著，5-azaC對兩材料干旱緩解作用濃度有差異，其中WT為C處理、D處理和E處理(2.5～7.5 μmol/L)，而PC則在F處理(10.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合PEG)具有最高的發(fā)芽率，低濃度5-azaC對芽期水稻干旱有緩解效果，且材料之間有差異。

2.2 噴施不同濃度5-azaC聯(lián)合10% PEG-6000 模擬干旱脅迫對水稻苗期的影響

2.2.1 葉片相對含水量 如圖1可知，較低濃度5-azaC處理對模擬干旱條件下水稻的保水能力有一定促進效果，其中WT的5-azaC促進作用濃度為2.5～50.0 μmol/L，而PC則為30.0～50.0 μmol/L，也呈現(xiàn)在該促進的作用濃度下，隨著濃度的增加，促進作用增強，但是到50.0 μmol/L(H處理)出現(xiàn)閾值，其中苗期兩材料DNA抑制劑處理濃度的差異提示兩材料DNA甲基化水平不同。當(dāng)達到100.0 μmol/L 5-azaC時，水稻葉片的RWC則顯著下降，兩材料的保水能力沒有顯著差別，繼續(xù)增加濃度，則與100.0 μmol/L 5-azaC處理均沒有顯著差異，而500.0 μmol/L 5-azaC處理則抑制更顯著，均低于單獨模擬干旱處理的水平，提示，DNA甲基化過程也參與水稻苗期干旱響應(yīng)，其中兩材料DNA甲基化水平的差異可能是其耐旱差異表現(xiàn)的內(nèi)在機制。結(jié)合供試水稻芽期和苗期的抑制劑作用濃度，可以看出，芽期<苗期。

表2 不同水稻材料在不同5-azaC濃度處理下發(fā)芽率的變化Tab.2 Germination rates of difference varieties at different concentrations of 5-azaC %

不同小寫字母表示0.05 水平上差異顯著(P<0.05)。圖2-8同。The different lowercase letters are significant difference at 0. 05 level (P<0.05)．The same as Fig.2-8.

2.2.2 葉片的C4-PEPC基因表達和PEPC酶活性 如圖2可知，小于50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理，與單獨干旱處理相比，對PC的C4-PEPC表達沒有顯著影響，與單獨模擬干旱的水平類似，但是高于這個濃度，則顯著抑制了該基因的表達水平。而對水稻葉片的PEPC酶活性則也存在濃度閾值，其中PC葉片中PEPC酶活性在30.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理活性顯著高于單獨干旱的處理，50.0，100.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理的均顯著低于其單獨干旱處理，但是還是高于未處理的對照，而500.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理則顯著抑制了PEPC酶活性；與PC相比，不同處理WT的酶活性均較低，DNA甲基化抑制劑對其影響的趨勢與PC的類似，基因表達和酶活性的表現(xiàn)與葉片的含水量有一致的表現(xiàn)。很顯然，低濃度的5-azaC聯(lián)合干旱處理增加了水稻酶活性，而隨著處理濃度的增加減少了兩材料酶活性差值的幅度，500.0 μmol/L 5-azaC處理的抑制最大，顯著低于未處理對照，提示外源導(dǎo)入的C4-PEPC與水稻DNA甲基化水平的差異表現(xiàn)有關(guān)。

2.2.3 葉片丙二醛含量 進一步選取了2個導(dǎo)致供試水稻葉片相對含水量差異表現(xiàn)的作用濃度(50.0，100.0 μmol/L 5-azaC)聯(lián)合模擬干旱處理，測定了植株倒二葉的丙二醛含量(圖3)。與B處理相比，H處理(DS+50.0 μmol/L 5-azaC)可以顯著降低相同水稻材料的MDA含量，其中PC的含量顯著小于WT的，而I處理(DS+100.0 μmol/L 5-azaC)則顯著增加了水稻MDA的含量，但兩材料含量不存在顯著差異，提示不同濃度的5-azaC處理造成了供試水稻膜脂過氧化水平差異，其中低濃度處理下PC的膜脂過氧化較低，傷害較少，有利于保持干旱脅迫下其葉片的水分。

圖2 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片C4-PEPC基因表達和PEPC酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative expression C4-PEPC and PEPC activities of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

圖3 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片丙二醛的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 5-azaC on MDA content of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.4 水稻葉片可溶性總糖、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量 從圖4-A可知，與B處理相比，H處理和I處理均顯著降低了PC水稻葉片可溶性糖的含量，但低濃度的H處理沒有改變兩材料的差異，PC仍大于WT，但是高濃度的I 處理下兩材料的含量不存在顯著差異；與DS處理相比，兩材料在低濃度的5-azaC+DS處理下的可溶性蛋白的含量不存在顯著差異，而高濃度則顯著降低了兩材料葉片的可溶性蛋白，且WT大于PC(圖4-B)；葉片中脯氨酸含量則與可溶性糖的含量變化趨勢相反，與DS處理相比，5-azaC+DS處理均顯著增加了脯氨酸含量，且5-azaC的濃度越高，其增幅越顯著，但是高濃度5-azaC+DS處理下兩材料的含量不存在顯著差異(圖4-C)，提示葉片中可溶性糖和脯氨酸含量的差異可能是兩材料干旱條件下DNA甲基化表現(xiàn)差異的重要物質(zhì)。

圖4 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of 5-azaC on soluble sugar，soluble protein and proline content of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.5 水稻葉片可溶性糖組分 從圖5水稻葉片可溶性糖組分可知，與B處理相比，H處理和I處理均顯著提高了PC中蔗糖含量，而低濃度5-azaC+DS處理則顯著降低了WT的蔗糖含量，而高濃度則顯著增加了WT的蔗糖含量(圖5-A)；與對照相比，B處理增加了WT的蔗糖含量而降低了PC的蔗糖含量。進一步與B處理相比，2個5-azaC+DS處理均顯著增加了兩材料的葡萄糖含量，但是品種間沒有顯著差異，提示導(dǎo)致2個5-azaC濃度差異的水稻干旱表現(xiàn)可能與葡萄糖關(guān)系不大(圖5-B)；與對照相比，B處理，均導(dǎo)致兩材料葉片內(nèi)果糖含量的增加，但兩材料含量不存在顯著差異，H處理(50.0 μmol/L 5-azaC)則提高了PC果糖含量，而降低了WT的果糖含量，恢復(fù)到與未處理對照的水平，而高濃度5-azaC聯(lián)合干旱處理則顯著降低了兩材料果糖的含量，而且品種間不存在顯著性差異(圖5-C)。

2.2.6 水稻葉片SnRK1基因表達 蔗糖非發(fā)酵1(Sucrose nonfermenting-1，SNF1)蛋白激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的能量和逆境的樞紐，在水稻中SnRK1亞家族包括3個基因，分別是OsSnRK1A、OsK24和OsK35[22]，并且與蔗糖含量密切相關(guān)[23]。從圖6可以看出，水稻的3個SnRK1基因的表達無論在單獨模擬干旱處理還是在50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合干旱處理均顯示了兩材料的差異，且PC大于WT，但在高濃度100.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合干旱處理則沒有顯著差異，提示蔗糖和糖信號基因表達的差異可能是導(dǎo)致水稻DNA甲基化水平差異的內(nèi)在機制。

圖5 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片蔗糖、葡萄糖和果糖含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of 5-azaC on sucrose，glucose and fructose contents of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

圖6 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片SnRK1s基因表達的影響Fig.6 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative gene expression of SnRK1s of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.2.7 水稻葉片甲基化酶基因的表達 作為最普遍類型的胞嘧啶甲基化，植物CG甲基化由主要的CG甲基化酶和甲基轉(zhuǎn)移酶1(MET1)保持，MET1基因的主要作用是保持CpG的甲基化[24]。水稻基因組中有2個MET1基因，分別為OsMET1a[25]和OsMET1b[26]。如圖7可知，與對照相比，DS處理降低了水稻的2個MET1基因的表達，而50 μmol/L 5-azaC+DS處理與DS處理下PC的OsMETIa表達水平?jīng)]有顯著差異，但是進一步降低了WT的基因表達水平，而高濃度5-azaC+DS干旱處理進一步顯著降低了兩材料的基因表達水平，仍然可以看出，PC的表達大于WT(圖7-A)，而對于OsMET1b，與其單獨干旱處理(B)相比,低濃度5-azaC+DS處理(H)顯著誘導(dǎo)了供試水稻的OsMET1b增加，但是對于同一處理(H)，PC的誘導(dǎo)水平顯著大于WT，而高濃度則顯著降低了PC相關(guān)的基因表達；而對高濃度WT的表達，與其低濃度的相比，則仍顯示顯著增加趨勢(圖7-B)，看來，DNA甲基化相關(guān)基因的表達水平與其5-azaC處理的表現(xiàn)一致，PC顯著高于WT。

圖7 模擬干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻苗期葉片OsMET1基因表達的影響Fig.7 Effects of different concentrations of 5-azaC on the relative gene expression of OsMET1 of rice leaves at seedling stage under simulated drought conditions

2.3 水稻劍葉的光合參數(shù)

進一步通過盆栽試驗，在生育后期，自然干旱處理并聯(lián)合噴施50.0，100.0 μmol/L 5-azaC溶液，觀察不同處理下水稻劍葉的光合參數(shù)的變化。如圖8-A可知，兩濃度均顯著抑制了水稻的凈光合速率，并沒有觀察到與芽期和苗期低濃度促進，高濃度抑制的趨勢，但在兩濃度下PC的凈光合速率數(shù)值始終顯著高于同樣處理下WT的，無論是對照，還是單獨或聯(lián)合干旱處理，PC仍然高于WT；50.0 μmol/L 5-azaC聯(lián)合模擬干旱處理顯著降低了水稻的氣孔導(dǎo)度，而100.0 μmol/L 5-azaC則顯著提高兩材料的氣孔導(dǎo)度(圖8-B)；蒸騰速率也是類似的表現(xiàn)(圖8-D)；相應(yīng)地，降低了100.0 μmol/L 5-azaC處理下的水分利用率(圖8-E)，而只提高WT的羧化效率(圖8-F)，看來，DNA甲基化抑制劑對生育后期水稻植株光合特性的影響更復(fù)雜。

圖8 自然干旱條件下不同濃度5-azaC對水稻開花后14 d劍葉的光合參數(shù)的影響Fig.8 Light parameters of the flag leaf in different varieties on 14th day after flowing at different 5-azaC concentrations under natural drought conditions

2.4 5-azaC對水稻產(chǎn)量構(gòu)成因子的影響

如表3盆栽試驗結(jié)果所示，單獨干旱處理顯著降低了水稻的株高，50.0 μmol/L 5-azaC+DS處理對水稻株高沒有顯著影響，與DS的類似，而高濃度100.0 μmol/L 5-azaC+DS處理顯著降低了WT的株高；DS處理也減少了單株穗數(shù)，5-azaC+DS處理可以部分緩解單株穗數(shù)的減少，其中PC的效果顯著，而WT的并不顯著；DS和50.0 μmol/L 5-azaC+DS對穗長影響不顯著，高濃度5-azaC+DS顯著降低了WT的穗長；穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量的表現(xiàn)與穗長的類似；DS處理也顯著減少了水稻的單穗實粒數(shù)，而且WT顯著小于PC。值得注意的是，與對照相比，DS和50.0 μmol/L 5-azaC+DS處理降低了WT的結(jié)實率，而高濃度的5-azaC+DS處理則顯著增加了水稻的結(jié)實率，但是由于DNA甲基化抑制劑對產(chǎn)量構(gòu)成的其他因子均呈負效應(yīng)，因此，最終的單株產(chǎn)量，2個DNA甲基化抑制劑聯(lián)合干旱處理對干旱條件下水稻產(chǎn)量的下降沒有顯著的緩解效果，其中高濃度100.0 μmol/L 5-azaC+DS處理對WT的抑制效果更大，顯著低于其DS和50 μmol/L 5-azaC+DS，可見，DNA甲基化水平在生育后期的調(diào)控更復(fù)雜，產(chǎn)量和劍葉的凈光合速率的變化類似，均是負效應(yīng)。

表3 不同水稻材料在不同處理下產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的變化Tab.3 Yields and composition of different varieties at different treatments

3 討論

DNA甲基化可通過調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因的表達，從而影響植物生長發(fā)育過程[27]。水稻在胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)和苗的生長等不同的生育期均具有不同的DNA甲基化動態(tài)變化[28]。水稻不同組織的DNA甲基化水平也有差異，如水稻胚乳中全基因組DNA 甲基化程度比胚中的低，主要表現(xiàn)為胚乳中儲存蛋白和淀粉合成相關(guān)基因的甲基化水平較低[29]。栽培稻遼粳944、藥用野生稻以及它們雜交后代的葉片和小穗DNA甲基化水平出現(xiàn)相同的趨勢，且隨著生長發(fā)育的進行，DNA甲基化水平均呈下降趨勢，雜種的總甲基化水平高于雙親[30]。本研究進一步通過DNA甲基化抑制劑(5-azaC)聯(lián)合干旱處理觀察到，在不同生育期，5-azaC對水稻干旱脅迫作用濃度不同，呈現(xiàn)芽期<苗期，且在同一生育期，表現(xiàn)為低濃度緩解干旱的抑制，而高濃度則加重干旱的抑制；本研究設(shè)置的5-azaC作用濃度對水稻生育后期效應(yīng)不顯著，高低濃度的5-azaC均顯著降低了干旱脅迫下水稻株高、劍葉的凈光合速率和單株產(chǎn)量，呈負效應(yīng)，其中5-azaC 作用于PC濃度均高于WT，顯示其具有較高的DNA甲基化水平。

逆境脅迫常常會引發(fā)植物DNA甲基化狀態(tài)的改變，這種改變會啟動植物體內(nèi)與逆境相關(guān)基因的表達以及某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，從而使植物能夠應(yīng)對外界不良環(huán)境[31]。水稻在干旱脅迫下DNA甲基化動態(tài)水平因品種、年份以及組織而異，而且部分基因的甲基化位點可以穩(wěn)定遺傳后代。如以中旱3號、汕優(yōu)63和矮仔占為材料，在10% PEG6000模擬干旱處理下研究其DNA甲基化動態(tài)變化表明，不同水稻品種的DNA甲基化程度存在品種間差異，其中中旱3號和汕優(yōu)63葉片中活性甲基循環(huán)過程受干旱脅迫誘導(dǎo)增加(甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達增加)，而矮仔占葉片中這一過程受到干旱脅迫的抑制(抑制了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達)[32]。在干旱脅迫處理下，降低水稻葉和根的甲基化程度有利于激活基因的表達，從而提高水稻耐旱性[33]。秈稻多基因聚合系DK151及其輪回親本IR64進行了連續(xù)3個季節(jié)的DNA甲基化水平測定，結(jié)果表明：干旱脅迫可以使水稻DNA甲基化發(fā)生變化，啟動抗旱相關(guān)基因的表達，使水稻抗旱性增強，這些干旱脅迫誘導(dǎo)的甲基化變化中約有四分之一的去甲基化位點在復(fù)水后不能恢復(fù)到原始狀態(tài)，而甲基化位點中約有一半不能恢復(fù)，可以遺傳給下一代[34]。在真核細胞中，5-氮雜胞苷(5-azaC)是一種抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性到基因組DNA低甲基化的類似物[35]。本研究結(jié)果表明：在干旱條件下，降低了水稻苗期葉片的甲基化酶基因的表達，低濃度的5-azaC施用繼續(xù)降低了內(nèi)源甲基化酶基因的表達，但是高濃度的施用則進一步降低了水稻苗期葉片的保水能力，顯著低于單獨干旱處理下葉片的相對含水量，提示該濃度可能嚴重干擾了水稻內(nèi)源DNA甲基化的動態(tài)平衡。需要注意的是這種濃度的調(diào)節(jié)效應(yīng)對水稻生育后期影響不大，表明水稻DNA甲基化水平調(diào)節(jié)很復(fù)雜，短期的干旱響應(yīng)與長期的干旱耐性的作用也不同。5-azaC在芽期和苗期的干旱脅迫調(diào)節(jié)效果存在品種間差異，耐旱性較強的PC具有較高的5-azaC增益作用濃度。

糖作為信號分子參與了植物對非生物脅迫的過程，其中SnRK作為聯(lián)系糖和非生物逆境的樞紐而發(fā)揮重要的作用[40]。在植物SnRK家族基因根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為3個亞家族，分別為SnRK1、SnRK2和SnRK3[22]。干旱條件下，PC水稻葉片中可溶性糖積累增強了其糖代謝和轉(zhuǎn)運[41]，并觀察到SnRK1[7]、SnRK2[38]和SnRK3[42]的參與，有利于其耐旱性的增強。本研究結(jié)果看出，與DS處理相比，50 μmol/L 5-azaC+DS處理使PC的OsMETIb表達顯著增加，而且也伴隨著其內(nèi)蔗糖、果糖含量和OSK24表達的顯著變化，其中蔗糖和果糖含量增加，OSK24表達顯著下降，而WT呈相反的變化趨勢，且與PC呈顯著差異，提示PC內(nèi)源可能通過糖信號的差異參與調(diào)節(jié)DNA甲基化對干旱的響應(yīng)，低濃度5-azaC處理誘導(dǎo)PC的DNA甲基化增強，但是當(dāng)5-azaC濃度提高到100 μmol/L，則均顯著抑制了兩材料的OsMETI基因的表達以及其他內(nèi)源組分差異，加劇干旱脅迫，且兩材料的耐旱表現(xiàn)差異均消除。植物DNA的甲基化和與之拮抗的去甲基化，共同決定了基因組總的甲基化水平及其分布模式，對維持正常的基因轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。而植物中主動去甲基化是通過一個雙功能糖基化酶和裂解酶直接將甲基化胞嘧啶從DNA上堿基切除修復(fù)來實現(xiàn)的[43]。需要關(guān)注的是植物中DNA甲基化過程是可逆的，會因高代而恢復(fù)逆境處理前水平。研究表明：去甲基化酶基因ROS1敲除導(dǎo)致子一代整體DNA甲基化的平衡破壞，并出現(xiàn)異常表型，如矮化和葉片變小，但該材料種植到第4代，植株總的DNA甲基化水平又可恢復(fù)到未處理水平，提示植物可能存在某種機制修復(fù)維持相對穩(wěn)定的DNA甲基化水平，從而有利于植物基因組和染色體狀態(tài)的穩(wěn)定[44]。本研究也觀察到無論是低濃度還是高濃度5-azaC均對生育后期水稻產(chǎn)生了不良影響，如矮化、凈光合速率下降和單株產(chǎn)量下降等，但對PC的影響似乎小于WT。PC對低濃度DNA甲基化抑制處理有部分耐受性，提示其內(nèi)源的DNA甲基化水平較高或者存在某種機制維持其體內(nèi)總DNA甲基化水平穩(wěn)定。PC糖信號表達差異是否參與水稻ROS1調(diào)節(jié)，有利于維持其基因組的穩(wěn)定性，值得深入研究。

低甲基化/去甲基化和誘變試劑5-azaC主要是通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性防止DNA甲基化[35]，已在不同的植物中應(yīng)用，但是因物種、劑量、時間和過程等導(dǎo)致了對植物發(fā)育的不同影響[45-52]，以往研究多用于處理離體細胞[48-49]、種子[28，37，50]或者植株發(fā)育早期如小孢子[51]以及愈傷組織[47，52]等，并可建立高頻的雙單倍體技術(shù)[51]、抗病[47，52]、抗除草劑[47]等新資源。本研究進一步研究了其在模擬干旱條件下水稻芽期和苗期的效應(yīng)，觀察到低濃度促進，而高濃度抑制，而且存在品種差異。但是，本研究進一步試圖將促進水稻芽期和苗期干旱脅迫緩解的5-azaC濃度處理生育后期水稻，期望獲得干旱緩解的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，但是在生育后期均是負效應(yīng)，由此可知，水稻DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)很復(fù)雜，未來要實現(xiàn)人工調(diào)節(jié)，還需要今后更多的濃度和更多的品種進行探索。無論如何，DNA甲基化作為表觀遺傳標(biāo)記提供了一種新的變異來源，通過調(diào)節(jié)其水平增強非生物逆境的潛力已經(jīng)顯現(xiàn)，相關(guān)研究將為科學(xué)家和育種者從提高作物抗性和減少產(chǎn)量損失方面帶來新的研究方向。

綜上，DNA甲基化參與了水稻干旱響應(yīng)，但不同生育期表現(xiàn)不同。其中糖信號在調(diào)節(jié)DNA甲基化機制以增強PC水稻干旱耐性中起重要作用。