韓佳良，王鶴萌，張冬瑞，常 纓

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors)是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，通過(guò)與其他蛋白質(zhì)復(fù)合物的特定序列或DNA的特定序列結(jié)合來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)[1]，也稱作反式作用因子。植物中的轉(zhuǎn)錄因子分為2種，一種是非特異型轉(zhuǎn)錄因子，它們非選擇性地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，還有一種稱為特異型轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

通過(guò)對(duì)番茄的一系列遺傳研究發(fā)現(xiàn)，番茄的果實(shí)形狀是由一個(gè)單隱性數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)控制的[2]。這個(gè)基因位點(diǎn)可以控制番茄的果實(shí)形狀由圓形變成梨形[3]，該位點(diǎn)被命名為梨形(pr)位點(diǎn)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)pr與控制果實(shí)由扁圓形變?yōu)闄E圓形的位點(diǎn)是等位的，因此又將該位點(diǎn)命名為卵形(o)位點(diǎn)[4]。2002年，Liu等[2]對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序和精細(xì)的定位分析，將卵形基因縮小到一個(gè)包含8個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)的55 kb片段中。對(duì)基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白的羧基端有一個(gè)70 aa的結(jié)構(gòu)域，被稱為OVATE結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)被指定為OVATE家族蛋白，也叫作卵形家族蛋白(OFPs)，這個(gè)結(jié)構(gòu)域在水稻和擬南芥中都是保守的。OVATE蛋白包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是假定的核定位信號(hào)(NLS)，另一個(gè)是Von Willebrand類型C因子 (VWFC)結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用所必需的。通過(guò)這些特征將OVATE蛋白與之前所確定的植物轉(zhuǎn)錄因子區(qū)分開(kāi)[2]。

迄今為止，OFPs主要在擬南芥中表現(xiàn)出來(lái)，AtOFPs是一類新型的，植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，并被證明與植物的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[5]。現(xiàn)有研究表明，AtOFP1會(huì)導(dǎo)致植物的地上器官包括下胚軸、蓮座葉、莖生葉的長(zhǎng)度均有所減少[6]；AtOFP4會(huì)抑制表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。2011年，Wang等[8]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中有18個(gè)基因被預(yù)測(cè)編碼卵形蛋白。但在2014年Liu等[9]發(fā)現(xiàn)2個(gè)以前未發(fā)現(xiàn)的AtOFP，At2g36026(命名為AtOFP19)和At1g06923(命名為AtOFP20)。由于AtOFP9失去了卵形家族蛋白典型的OVATE結(jié)構(gòu)域，所以AtOFP9被從擬南芥卵形家族蛋白中剃除，因此，擬南芥卵形蛋白家族成員由原來(lái)的18個(gè)變?yōu)楝F(xiàn)在的19個(gè)，這些基因分布在5條染色體上。

植物激素是存在于植物體內(nèi)的有機(jī)小分子[10]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)時(shí)期均有作用，包括植物種子發(fā)芽、開(kāi)花、結(jié)果、植物體的生長(zhǎng)以及植物體凋零階段[11]。當(dāng)植物面對(duì)不利的環(huán)境因素時(shí)，細(xì)胞會(huì)從舒適狀態(tài)變?yōu)槊{迫響應(yīng)狀態(tài)，這一系列的生理狀態(tài)變化主要取決于對(duì)脅迫狀態(tài)信號(hào)的感知、轉(zhuǎn)錄因子的活化、激素的變化等一系列過(guò)程[12]。現(xiàn)研究表明，植物激素對(duì)蘿卜中的RsOFP2.3的表達(dá)有影響[13]，表明RsOFP2.3受到激素的調(diào)控進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

目前為止，對(duì)AtOFPs中其他AtOFP的功能已有了深入的研究，但對(duì)新發(fā)現(xiàn)的AtOFP19基因的研究知之甚少。本試驗(yàn)基于TAIR網(wǎng)站上的信息對(duì)AtOFP19基因進(jìn)行初步分析，并利用生物信息學(xué)對(duì)AtOFP19蛋白結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，還完成了轉(zhuǎn)錄活性、亞細(xì)胞定位、激素處理等試驗(yàn)，對(duì)AtOFP19基因功能進(jìn)行初步研究，對(duì)后續(xù)研究AtOFP19基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選用哥倫比亞(Col)野生型擬南芥種子，訂購(gòu)于ABRC(Arabidopis Biological Resource Center)的T-DNA插入突變體(atofp19)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1AtOFP19基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)查詢基因的基本信息。用NCBI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。應(yīng)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別應(yīng)用SOPMA、SWISS-MODEL軟件。使用SignalP軟件分析信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用最新的擬南芥亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站SUBA4軟件[14]。網(wǎng)站鏈接見(jiàn)表1。

表1 生物信息學(xué)網(wǎng)站Tab.1 Bioinformatics website link

1.2.2 擬南芥的種植與培養(yǎng) 將約100粒擬南芥種子放入干凈的2 mL EP管中，加入1 mL 30% 84消毒液，放入搖床中室溫振蕩15～20 min。用蒸餾水清洗消毒過(guò)的擬南芥種子，連續(xù)清洗4次盡量保證將消毒液清洗完全。用移液器把種子均勻點(diǎn)在固體培養(yǎng)基中，將種子鋪勻。密封，避光放入4 ℃冰箱培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的種子放在組培架上用垂直光照進(jìn)行培養(yǎng)。7～10 d后，用鑷子把擬南芥幼苗移種到土壤中，每2 d澆水一次。

1.2.3AtOFP19基因克隆 采用植物總RNA提取試劑盒(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)提取擬南芥總RNA，利用HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以擬南芥cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20.0 μL：2×Taqmix 酶，上下游引物各 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，連接PUC載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送至庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 35S∶HA-AtOFP19轉(zhuǎn)基因植株的獲得 選擇XbaⅡ、BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)用限制性內(nèi)切酶酶切pBI121載體，對(duì)載體進(jìn)行線性化。利用ClonExpress One Step Cloning試劑盒將目的基因與載體連接。引物設(shè)計(jì)的總原則：通過(guò)在引物5′端引入同源序列，使擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列。插入片段PCR擴(kuò)增，使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染擬南芥，具體步驟參考蔡玲[15]的研究。將浸染后的植株，用蓋子蓋好(不透光)室溫避光一夜，第2天拿到培養(yǎng)架上，正放培養(yǎng)。將擬南芥植株轉(zhuǎn)化后得到的第1批種子稱為T(mén)1。將滅菌后的T1種子種到含有Kan(50 mg/mL)抗性的1/2MS固體培養(yǎng)基中，篩選出綠色幼苗，移到土壤中培養(yǎng)。收集T1植株的種子稱為T(mén)2，按照上述步驟重復(fù)操作，得到純合35S∶HA-AtOFP19轉(zhuǎn)基因植物。

1.2.5 亞細(xì)胞定位的觀察 構(gòu)建pCAMBIA1302-AtOFP19-GFP載體，通過(guò)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)[16]將載體轉(zhuǎn)入到原生質(zhì)體中，在遮光室溫條件下孵育16 h，用移液器將少量的原生質(zhì)體溶液滴加在載玻片上，由一端輕輕地將蓋玻片蓋到載玻片上，要盡量避免產(chǎn)生氣泡。在蓋玻片的表面滴加少量的鏡油，選擇GFP激發(fā)光，利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位情況，并拍攝記錄。

1.2.6 熒光定量試驗(yàn) 熒光定量試驗(yàn)采用全式金公司熒光定量試劑盒，以β-Actin為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR，每次試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)(表2)。

1.2.7 AtOFP19對(duì)種子萌發(fā)的影響 將WT種子、OE種子、atofp19種子，用30% 84消毒液消毒10 min，無(wú)菌水漂洗5～6次。將3種種子接種到無(wú)激素?zé)o抗性1/2MS培養(yǎng)基上，每個(gè)平板中接種100粒種子，4 ℃春化2 d，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以胚根突破種皮為萌發(fā)標(biāo)志，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d。相同的試驗(yàn)進(jìn)行3次，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表2 熒光定量體系Tab.2 Fluorescence quantitative system

1.2.8 激素調(diào)控AtOFP19基因的表達(dá)量 將野生型擬南芥種子接種到含不同濃度脫落酸ABA(0.2，0.5，1.0 μmol/L)、細(xì)胞分裂素6-BA(0.5，1.0，2.0 μmol/L)、赤霉素GA3(0.5，1.0，2.0 μmol/L)、生長(zhǎng)素IBA(0.5，1.0，2.0 μmol/L)和乙烯利ETH(0.2，0.5，1.0 μmol/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，以不添加激素處理為對(duì)照，選取最適濃度培養(yǎng)基中的幼苗移到土壤里培養(yǎng)，qRT-PCR測(cè)定AtOFP19基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtOFP19基因生物信息學(xué)分析

2.1.1AtOFP19基因的分析 在已發(fā)表的文獻(xiàn)中可查詢AtOFP19基因的基因號(hào)為AT2G36026.1。在TAIR網(wǎng)站上查詢AtOFP19基因的基本信息?？芍?，AtOFP19基因全長(zhǎng)552 bp，CDS區(qū)552 bp，無(wú)內(nèi)含子，位于第2號(hào)染色體。

2.1.2 AtOFP19保守結(jié)構(gòu)域分析 應(yīng)用NCBI對(duì)AtOFP19保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，作為AtOFPs中的一員，AtOFP19蛋白在C末端有一個(gè)OVATE保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，與家族中其他成員一樣擁有OVATE蛋白家族特征結(jié)構(gòu)域，并且除了這個(gè)結(jié)構(gòu)域外，AtOFP19蛋白中未預(yù)測(cè)到其他已知的結(jié)構(gòu)域。

2.1.3 AtOFP19蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)分析 對(duì)AtOFP19蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，AtOFP19蛋白由183個(gè)氨基酸組成，AtOFP19蛋白的分子式為C892H1386N260O272S8，分子量為20.36 ku，理論等電點(diǎn)為9.32(圖2)。

通過(guò)對(duì)AtOFP19基因編碼的氨基酸進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AtOFP19蛋白質(zhì)由19種氨基酸組成，其中Ser含量最多，占氨基酸總數(shù)的17.5%，Leu、Lys、Ala次之，Trp含量最少，僅占氨基酸總數(shù)的1.1%。帶正電荷的氨基酸殘基 (Asp+Glu)總數(shù)為16個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為23個(gè)(圖3)。

圖1 AtOFP19保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of conserved domains about the AtOFP19 protein

圖2 AtOFP19蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of AtOFP19 protein primary structure

圖3 AtOFP19蛋白氨基酸組成分析Fig.3 Amino acid composition analysis of the AtOFP19 protein

2.1.4 AtOFP19蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用SOPMA對(duì)AtOFP19編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，在AtOFP19蛋白中，無(wú)規(guī)卷曲 (Random coil)含量最多，占48.09%，是AtOFP19蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件；α螺旋 (Alpha helix)和延伸鏈 (Extended strand)次之，分別占28.96%，18.03%，β轉(zhuǎn)角 (Beta turn)最少，占4.92%(圖4)。

利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)AtOFP19蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)AtOFP19的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AtOFP19蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中構(gòu)成元件與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致(圖5)。

2.1.5 AtOFP19蛋白信號(hào)肽分析 應(yīng)用SignalP在線分析軟件對(duì)AtOFP19蛋白編碼的氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在N端前70個(gè)氨基酸中，最大的S值為0.003 8，推測(cè)AtOFP19蛋白不具有信號(hào)肽，是非分泌蛋白(圖6)。

2.1.6 AtOFP19蛋白亞細(xì)胞定位分析 AtOFP19是轉(zhuǎn)錄因子OVATE家族中的一員，應(yīng)用最新的擬南芥亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站SUBA4對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AtOF19蛋白被預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞核中(圖7)。

Hh.α螺旋；Ee.延伸鏈；Tt.β轉(zhuǎn)角；Cc.無(wú)規(guī)卷曲。Hh.Alpha helix；Ee.Extended strand；Tt.Beta turn；Cc.Random coil.

圖5 AtOFP19蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of AtOFP19 protein tertiary structure

圖6 AtOFP19蛋白信號(hào)肽分析Fig.6 Signaling peptide analysis of AtOFP19 protein

圖7 AtOFP19蛋白亞細(xì)胞定位分析Fig.7 Subunit localization analysis of AtOFP19 protein

2.2 AtOFP19基因的克隆

提取擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)克隆得到AtOFP19基因。PCR產(chǎn)物大小在550 bp左右，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致(圖8)，并通過(guò)基因測(cè)序分析驗(yàn)證了得到的目的片段為AtOFP19基因。

2.3 AtOFP19亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建帶有GFP信號(hào)的載體轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況。結(jié)果如圖9所示，AtOFP19-GFP融合蛋白只在細(xì)胞核中表達(dá)，說(shuō)明AtOFP19蛋白定位在細(xì)胞核中。

M.Marker；M1、M2、M3. AtOFP19基因條帶。M.Marker；M1，M2，M3. AtOFP19 gene.

A.綠色熒光；B.明場(chǎng)；C.疊加。A. Fluorescence；B.Normal light；C.Merged.

2.4 AtOFP19基因表達(dá)分析

2.4.1AtOFP19基因組織表達(dá)分析 取生長(zhǎng)到35 d左右的擬南芥為材料，利用qRT-PCR對(duì)AtOFP19基因在擬南芥各部位表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，AtOFP19基因在根、莖、葉、花、角果中均有表達(dá)，在莖生葉和花中的表達(dá)量相對(duì)較高，其中在花中的表達(dá)量最高，在角果、根、莖中的表達(dá)量較少。這些結(jié)果表明，AtOFP19基因在擬南芥花和莖生葉的形成過(guò)程中起作用(圖10)。

不同小寫(xiě)字母表示0.05水平差異顯著性。圖11，12，15同。Different lowercase letters indicate significant differences in 0.05 levels.The same as Fig.11，12，15.

2.4.2AtOFP19基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析 每隔10 d取WT植株為材料，進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定AtOFP19基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，AtOFP19基因在擬南芥幼苗生長(zhǎng)初期階段(10 d)表達(dá)量較高，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育AtOFP19基因的表達(dá)量下降，到開(kāi)花時(shí)期(50 d)表達(dá)量又升高(圖11)。這暗示著AtOFP19基因在擬南芥幼苗生長(zhǎng)階段與植株開(kāi)花階段起作用。

圖11 AtOFP19基因在不同時(shí)期的表達(dá)量

2.5 AtOFP19是轉(zhuǎn)錄抑制子

構(gòu)建PUC-GD-AtOFP19載體，以LD-VP16、GD、GD-AtOFP19為效應(yīng)基因，Lex-Gal4∶GUS為報(bào)告基因共同利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體中，檢測(cè)GUS的相對(duì)表達(dá)量，來(lái)檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性。已知LD-VP16是轉(zhuǎn)錄激活子，它能夠激活報(bào)告基因的表達(dá)，因此將GD、LD-VP16和報(bào)告基因Lex-Gal4∶GUS共轉(zhuǎn)染到原生質(zhì)體中，報(bào)告基因GUS表達(dá)量會(huì)高表達(dá)。結(jié)果表明，GD-AtOFP19、LD-VP16和報(bào)告基因Lex-Gal4∶GUS的試驗(yàn)組中GUS表達(dá)量較對(duì)照組低(圖12)。因此，證明了AtOFP19具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。

圖12 AtOFP19為轉(zhuǎn)錄抑制子Fig.12 AtOFP19 is a transcriptional repressor

2.6 35S∶HA-AtOFP19轉(zhuǎn)基因植株、atofp19突變體植株與野生型植株表型對(duì)比

將構(gòu)建的pBI121-HA-AtOFP19載體利用農(nóng)桿菌浸染技術(shù)轉(zhuǎn)入野生型植株中，篩選得到2株純合OE植株(OE1、OE2)。將OE、atofp19與WT的表型進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)WT與atofp19的表型沒(méi)有明顯差異，而與WT相比，OE植株蓮座葉較小，莖細(xì)，植株整體細(xì)小(圖13)。

A.野生型植株；B.atofp19轉(zhuǎn)基因植株；C.OE轉(zhuǎn)基因植株。A. Wild type plants；B. atofp19 mutant plants；C.OE transgenic plants.

2.7 AtOFP19抑制種子萌發(fā)

種子休眠和萌發(fā)受到種子內(nèi)部生長(zhǎng)物質(zhì)的調(diào)控和外部環(huán)境因子的影響，是一個(gè)十分復(fù)雜的生理過(guò)程。為研究AtOFP19是否在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中起作用，本試驗(yàn)將OE、atofp19與WT的種子種到無(wú)激素?zé)o抗性的1/2MS培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)1～7 d種子萌發(fā)率。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)4 d后種子萌發(fā)率基本穩(wěn)定。與WT植株種子的萌發(fā)率相比，OE植株種子萌發(fā)率較低，而atofp19植株種子萌發(fā)率較高(圖14)，表明AtOFP19對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)具有抑制作用。

圖14 種子萌發(fā)率Fig.14 Seed germination rate

2.8 AtOFP19基因受6-BA激素的調(diào)控

為探究AtOFP19基因的表達(dá)是否受到激素的調(diào)控，將WT種子接種到含不同濃度 ABA、6-BA、GA3、IBA和ETH的1/2MS培養(yǎng)基上，以不添加激素為對(duì)照，篩選出生長(zhǎng)狀況較好的幼苗移到土壤里培養(yǎng)，利用qRT-PCR測(cè)定AtOFP19基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖所示，6-BA處理組中的AtOFP19基因表達(dá)量最高。而ABA、GA3、IBA處理組植株中的AtOFP19基因表達(dá)量與對(duì)照組的無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖15)，表明AtOFP19基因的表達(dá)主要受6-BA的調(diào)控。

圖15 激素處理后AtOFP19基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

2011年Wang等[8]為研究AtOFPs在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮的作用，利用生物信息學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)表型觀察等方法對(duì)擬南芥AtOFP基因進(jìn)行了分析。觀察過(guò)表達(dá)AtOFPs植物的表型發(fā)現(xiàn)AtOFP1、AtOFP2、AtOFP4、AtOFP5和AtOFP7過(guò)表達(dá)的植物表型為腎形子葉和圓形、卷曲的葉子，花發(fā)育遲緩，蓮座葉較小，結(jié)實(shí)率下降，將這幾個(gè)基因歸為Ⅰ類AtOFP基因。過(guò)表達(dá)AtOFP6和AtOFP8的植物表型為扁平、厚的青色蓮座葉，歸為Ⅱ類AtOFP基因。過(guò)表達(dá)AtOFP13、AtOFP15、AtOFP16和AtOFP18的植物表型相似，為蓮座葉較小，結(jié)實(shí)率降低，花發(fā)育延遲，角果末端鈍平，歸為Ⅲ類AtOFP基因[8]。本試驗(yàn)成功地獲得了過(guò)表達(dá)AtOFP19植株，其表型為蓮座葉較小，莖細(xì)，植株矮小，與Ⅲ類基因的表型相似。

在2007年發(fā)現(xiàn)了AtOFP1是轉(zhuǎn)錄抑制因子，在植物細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中起抑制作用[6]。2011年Li等[5]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AtOFP2、AtOFP7的植株表型與過(guò)表達(dá)AtOFP1的植株表型相似，通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了AtOFP2、AtOFP7也是轉(zhuǎn)錄抑制因子。在此之后Wang等[8]證實(shí)了其他AtOFPs也是轉(zhuǎn)錄抑制因子，這表明AtOFPs可能是一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建PUC-GD-AtOFP19載體，利用原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，酶標(biāo)儀測(cè)定試驗(yàn)組和對(duì)照組的GUS相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組中GUS表達(dá)量較對(duì)照組低，驗(yàn)證了AtOFP19也是轉(zhuǎn)錄抑制子。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB類轉(zhuǎn)錄因子會(huì)通過(guò)多種途徑參與植物對(duì)干旱脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、重金屬脅迫、鹽脅迫的響應(yīng)[17-19]，同時(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物體內(nèi)的激素具有調(diào)節(jié)作用[20]?，F(xiàn)研究表明，植物激素對(duì)蘿卜中的RsOFP2.3的表達(dá)有影響，在12 h內(nèi)，RsOFP2.3的表達(dá)對(duì)ABA、NAA、6-BA和GA3的反應(yīng)顯著上調(diào)，并且對(duì)GA3處理最敏感，其次是6-BA、ABA和NAA，而在處理12，24 h后對(duì)乙烯的反應(yīng)均無(wú)明顯變化，這表明RsOFP2.3受到激素的調(diào)控進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[13]。那么擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子AtOFP19是否也受到植物激素的調(diào)控，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtOFP19的表達(dá)量受到6-BA的調(diào)控，而其他激素對(duì)AtOFP19表達(dá)量的調(diào)控沒(méi)有明顯作用，這暗示著AtOFP19基因主要受到6-BA激素的調(diào)控進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，其調(diào)控的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步試驗(yàn)探究。