鄭藝超，張 昊，，趙 丹，3，王鳳茹，劉西崗，郭 琳

(1.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，分子細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；3.衡水學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000)

MYB(v-MYB avian myeloblastosis viral)是一類在植物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。30 a前，人們從玉米(Zeamays)中鑒定出了第一個(gè)植物MYB基因-COLORED1(C1)，C1基因編碼的MYB結(jié)構(gòu)域蛋白是合成玉米糊粉中花青素所必需的蛋白[1]。從那時(shí)起，植物MYB基因的功能得到了人們的廣泛關(guān)注。20 a前，擬南芥基因組序列發(fā)表，首次對(duì)植物MYB基因進(jìn)行了全面的描述和分類[2]。之后MYB基因在擬南芥、玉米、水稻、矮牽牛花、金魚草、葡萄、白楊、蘋果和番茄等植物中的功能也通過(guò)遺傳和分子分析得到了證實(shí)[3-4]。

MYB基因表達(dá)的蛋白具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：MYB結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常由至多4個(gè)重復(fù)序列(R1、R2、R3、R4)組成，每個(gè)重復(fù)序列包含52個(gè)氨基酸，能夠形成3個(gè)α螺旋。并且每個(gè)重復(fù)序列的第二和第三螺旋會(huì)與3個(gè)規(guī)則間隔的色氨酸殘基形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，其中色氨酸殘基構(gòu)成了三維HTH結(jié)構(gòu)中的疏水核心[5]。MYB蛋白可分為1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB(4個(gè)R1/R2的重復(fù))4種不同的亞類[6-7]。迄今分離出的大多數(shù)植物MYB基因編碼的DNA結(jié)合域由2個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成，這2個(gè)重復(fù)序列與動(dòng)物c-MYB蛋白的R2和R3重復(fù)序列最相似[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，MYB基因是microRNA(miRNAs)和ta-siRNA(ta-siRNAs)的靶點(diǎn)[11]，同時(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子也是其他調(diào)控因子的直接靶點(diǎn)[12]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中可以發(fā)揮很多功能，例如調(diào)控初級(jí)和次級(jí)代謝，影響細(xì)胞生命活動(dòng)，控制花青素和黃酮醇的生物合成[13]，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[14]，參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)等[15]。

迄今為止，人們已經(jīng)研究和報(bào)道了很多MYB家族基因在擬南芥中的功能：AtMYB30被證明在控制下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)的油菜素內(nèi)酯途徑中發(fā)揮重要作用[16]；AtMYB60和AtMYB96能夠通過(guò)ABA信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)[17]、干旱脅迫和抗病性[18]；AtMYB23與AtMYB5聯(lián)合調(diào)控毛狀體的伸長(zhǎng)和分支[19-20]，AtMYB5還調(diào)控外種皮分化[21]；AtMYB16/MIXTA控制花瓣表皮細(xì)胞的形狀[22]，和AtMYB17一起作為早期花序發(fā)育和種子萌發(fā)的調(diào)控因子[23]；MYB28和MYB29參與植物胺脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)[24]；AtMYB103調(diào)控纖維素的生物合成[25]；AtMYB61發(fā)揮多效作用，影響木質(zhì)素沉積[26]、黏液生成[27]和氣孔孔徑[28]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，AtMYB54參與了鹽脅迫響應(yīng)，在抗逆中發(fā)揮了一定功能。闡明MYB蛋白在生長(zhǎng)發(fā)育和干旱脅迫的功能和調(diào)控作用，能夠?yàn)轭A(yù)測(cè)MYB蛋白在小麥等其他植物物種中的功能提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究主要對(duì)擬南芥和小麥中MYB54在不同物種之間的保守性、蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、高溫脅迫進(jìn)行了研究分析，并在擬南芥中對(duì)MYB54蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行初步探究，為MYB54在植物中的功能研究提供理論基礎(chǔ)，以期能在作物產(chǎn)量應(yīng)用中提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇的植物材料為蘭茲貝格(Landsberg erecta)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，載體構(gòu)建所用的菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，蛋白誘導(dǎo)所用的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，酵母菌株為Y2HGold，此材料都為劉西崗實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RT-PCR mix為Thermo公司購(gòu)買，膠回收試劑盒為Biomiga公司購(gòu)買。酵母轉(zhuǎn)化試劑盒為北京Coolaber公司購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MYB54的生物信息學(xué)分析 利用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站和TAIR網(wǎng)站(http：//www.arabidopsis.org)對(duì)MYB54的蛋白序列進(jìn)行搜索，并將蛋白序列導(dǎo)入到https：//plants.ensembl.org/index.html網(wǎng)站中進(jìn)行不同物種之間的同源對(duì)比，利用MEGA 10軟件對(duì)不同物種之間的MYB54蛋白進(jìn)行進(jìn)化學(xué)分析。同時(shí)利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)MYB54的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；利用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL(http：//www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)MYB54蛋白三維空間結(jié)構(gòu)。

1.2.2MYB54在擬南芥中的不同部位的表達(dá)量分析 選取16 h光照/8 h黑暗條件下生長(zhǎng)了40 d的野生型擬南芥植株，取全根、蓮座葉、莖生葉、花序以及果莢組織。利用TRIzol法提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，內(nèi)參基因?yàn)閁BQ5。反應(yīng)總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

1.2.3 高溫和低溫處理下擬南芥幼苗MYB54的表達(dá)量分析 將野生型Ler的種子用75%乙醇消毒后，鋪在1/2MS培養(yǎng)基中，在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下生長(zhǎng)8 d后，將幼苗分別放入4，30 ℃進(jìn)行高溫和低溫處理，2 h后全苗取樣，進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后利用RT-PCR測(cè)定MYB54的表達(dá)量。反應(yīng)總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，內(nèi)參基因?yàn)閁BQ5。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

1.2.4 熱脅迫下小麥中MYB54基因的表達(dá)量分析 將大小均一飽滿的KN9204小麥種子，用2.5%次氯酸鈉浸泡2 min，隨后再用蒸餾水沖洗3次，沖洗干凈后，均勻擺放在盛有蛭石的培養(yǎng)皿中，并將種子放入22 ℃培養(yǎng)箱中，在16 h光照，8 h黑暗條件中萌發(fā)，待小麥長(zhǎng)至一葉一心時(shí)期在4 ℃進(jìn)行春化處理28 d，隨后將幼苗移栽進(jìn)培養(yǎng)土中(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，在12 h光照(18 ℃)，12 h黑暗(13 ℃)進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，分別進(jìn)行4 ℃冷處理和30 ℃熱處理，處理2 h后全苗取材，隨后利用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)總體系為10 μL，2×RT-PCR mix 5 μL，cDNA 1 μL，引物(Forward+Reverse)1 μL，ddH2O 3 μL，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃制備溶解曲線。所用引物為表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 MYB54蛋白相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建 利用snapgene軟件對(duì)MYB54基因 CDS序列以及pGEX-4T-1，pGBKT7表達(dá)載體進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，用EcoR Ⅰ和SalⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)目的基因和載體進(jìn)行酶切回收，25 ℃條件下，用T4連接酶將MYB54基因 CDS序列與pGST-4T-1與pGBKT7載體連接，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，加500 μL無(wú)抗LB培養(yǎng)液，并均勻涂布在氨芐霉素LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取20個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定出的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，利用BamH Ⅰ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將酶切正確的重組質(zhì)粒送金唯智公司(GENEWIZ)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 pGEX-4T-1-MYB54蛋白誘導(dǎo)純化 考馬斯亮藍(lán)染色以及Western Blot檢測(cè) 將構(gòu)建好的pGEX-4T-1-MYB54重組質(zhì)粒利用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落加入5 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中220 r/min培育12～14 h，后轉(zhuǎn)入250 mL的氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)培4～5 h，待菌液OD600值達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG，使其終濃度為0.3 μmol/L，分別在18 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)，30 ℃誘導(dǎo)6 h，37 ℃誘導(dǎo)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌液，利用超聲儀對(duì)菌液進(jìn)行超聲破碎，將超聲后的上清加入GST凝膠樹脂進(jìn)行蛋白純化，在4 ℃搖床中孵育4～6 h，將純化出的GST-MYB54蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色，并選取最適誘導(dǎo)條件下的純化蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.7 MYB54在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 利用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)MYB54的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-MYB54用于轉(zhuǎn)化酵母菌株。首先將酵母菌株Y2HGold在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取直徑2～3 mm的單克隆于3 mL YPDA培養(yǎng)液中，30 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)8 h，吸取100 μL～10 mL YPDA中，30 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h，直至OD600達(dá)到 0.5左右。提前將1.5 mL離心管，槍頭，ddH2O高溫滅菌。用1.5 mL的離心管1 000 r/min離心2 min收集菌體2次，倒去上清并用1 mL無(wú)菌ddH2O重懸酵母；目的是洗去殘留的YPDA培養(yǎng)液，再次室溫1 000 r/mim離心2 min收集菌體，倒去上清并加入 1 mL 10× TE/LiAc，500 μL PEG8000和10 μL Carrier DNA 溶液重懸酵母；同時(shí)加入pGBKT7-MYB54重組質(zhì)?；騪ADT7空質(zhì)粒作為對(duì)照。振蕩混勻后30 ℃水浴 30 min，每 10 min 上下顛倒混勻1次。靜置過(guò)夜后在42 ℃水浴鍋中熱激30 min，每10 min上下顛倒混勻1次。3 000 r/min離心5 min后，倒掉上清加入100 μL無(wú)菌水，重懸菌體后鋪在SD-Leu/-Trp的培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)接到SD-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后，觀察酵母生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB54系統(tǒng)進(jìn)化樹分析以及氨基酸序列對(duì)比

利用生物信息學(xué)軟件，將擬南芥中的MYB54蛋白序列與歐洲油菜(Brassicanapus)、芥藍(lán)(Brassicaoleracea)、白菜(Brassicarapa)、亞麻薺(Camelinasativa)、圓錐南芥(ArabisalpinaA)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianaattenuata)、水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalica)、小麥(Triticumaestivum)和番茄(Solanumlycopersicum)進(jìn)行了蛋白同源性分析，如圖1所示，擬南芥中的MYB54蛋白與十字花科中的芥藍(lán)、白菜、亞麻薺等同源性比較接近，分別達(dá)到了87%，87%，81%，與禾本科植物高粱、谷子和水稻的同源性較低，分別為54%，57%，47%，與小麥和番茄的同源性為42%。同時(shí)，通過(guò)圖2中MYB54的氨基酸序列比對(duì)可以看出，在不同物種之間，MYB54具有非常保守的一段氨基酸序列，這段序列包含20個(gè)氨基酸片段，位于MYB-like DNA-binding 結(jié)構(gòu)域之中。

圖1 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis

2.2 MYB54氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

小麥作為我國(guó)主要的糧食作物之一，其中基因功能的研究對(duì)小麥育種具有重要的意義和價(jià)值，隨后筆者利用 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站對(duì)MYB54蛋白分別在擬南芥和小麥中的氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果如圖3-5所示，擬南芥中MYB54蛋白具有243個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為28.169 ku，等電點(diǎn)為10.17。小麥中MYB54蛋白具有275個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為29.881 ku，等電點(diǎn)為10.005 4，對(duì)比圖3-A、B可以看出，MYB54在小麥和擬南芥中存在非常保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如MYB-like DNA-binding結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在小麥和擬南芥中都存在，包含MYB蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及與核小體滑動(dòng)相關(guān)的SANT(“SWI3，ADA2，N-CoR and TFIIB”)結(jié)構(gòu)域[29]。用同源模型服務(wù)軟件 SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)分別對(duì)擬南芥和小麥中的MYB54蛋白進(jìn)行三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4-A和圖5-A所示。擬南芥中MYB54蛋白在第84位疏水性最高，峰值為2.15，在第157位親水性最高，峰值為-1.71，結(jié)合ProtPram預(yù)測(cè)的平均親水性為0.03，分析可知該蛋白為親水性蛋白。小麥中MYB54蛋白在第1位疏水性最高，峰值為2.83，在第82位親水性最高，峰值為-1.58，平均親水性為0.04，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。同時(shí)對(duì)擬南芥和小麥中MYB54蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，擬南芥MYB54蛋白包含96個(gè)螺旋，36個(gè)折疊，111個(gè)卷曲。小麥MYB54蛋白包含87個(gè)螺旋，48個(gè)折疊以及140個(gè)卷曲(圖4-B-D和圖5-B-D)。綜合以上數(shù)據(jù)，可以看出小麥中MYB54蛋白與擬南芥中MYB54蛋白在保守結(jié)構(gòu)域、親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)都十分相似，所以對(duì)擬南芥中MYB54蛋白的研究能夠?yàn)轭A(yù)測(cè)小麥中MYB54蛋白功能提供有力的理論依據(jù)。

圖2 MYB54氨基酸序列同源對(duì)比Fig.2 MYB54 amino acid homology comparison

A.擬南芥MYB54蛋白序列；B.小麥MYB54蛋白序列。A. Arabidopsis MYB54 protein sequence；B. Wheat MYB54 protein sequence.

A.蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B.疏水性預(yù)測(cè)；C.親水性預(yù)測(cè)；D.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖5同。A.Prediction of tertiary structure of proteins；B.Hydrophobicity prediction；C. Hydrophilicity prediction；D. Protein secondary structure prediction；The same as Fig.5.

圖5 小麥MYB54蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析Fig.5 MYB54 protein bioinformatics analysis in wheat

2.3 MYB54基因在擬南芥不同組織的表達(dá)量分析

以擬南芥野生型(Ler)為材料，利用RT-PCR分別對(duì)根、蓮座葉、莖生葉、花、果莢中的MYB54表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，在這些組織中MYB54均有表達(dá)，但在果莢中的表達(dá)量最高，在花序和根中的表達(dá)量次之，在蓮座葉和莖生葉中的表達(dá)量最少。綜合以上結(jié)果，猜測(cè)MYB54可能在生殖發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。

2.4 擬南芥MYB54基因在高溫和低溫處理下的表達(dá)量分析

對(duì)野生型幼苗進(jìn)行高溫和低溫處理，2 h后檢測(cè)MYB54基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示，高溫處理后，MYB54基因的表達(dá)顯著降低，表明MYB54能夠響應(yīng)高溫脅迫，而在低溫處理后，MYB54基因的表達(dá)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，這與前人在熱脅迫中MYB54功能的研究相印證。

2.5 小麥MYB54基因在高溫和低溫處理下的表達(dá)量分析

隨后對(duì)兩葉一心時(shí)期的小麥幼苗進(jìn)行高溫和低溫處理，2 h后檢測(cè)了MYB54基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖8所示，高溫處理之后，MYB54的表達(dá)量與對(duì)照組相比下降1/2，低溫處理之后，MYB54的表達(dá)量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，這些結(jié)果與擬南芥中MYB54基因的變化趨勢(shì)一致，表明MYB54對(duì)熱較敏感，高溫可以抑制MYB54的表達(dá)。

n=3，采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的顯著性；不同字母表示數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。圖7-8同。

圖7 高溫和低溫脅迫下擬南芥MYB54基因的表達(dá)Fig.7 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in Arabidopsis

圖8 高溫和低溫脅迫下小麥MYB54基因的表達(dá)Fig.8 Expression of MYB54 gene under high and low temperature stress in wheat

2.6 MYB54蛋白的誘導(dǎo)純化以及Western Blot分析

為了探索pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白的最適誘導(dǎo)純化條件，分別在18，30，37 ℃對(duì)該蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，之后通過(guò)凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)誘導(dǎo)純化結(jié)果進(jìn)行分析。MYB54蛋白分子量大小約為27 ku，GST蛋白分子量大小約為26 ku，故融合蛋白分子量大小約為53 ku。結(jié)果如圖9所示，18，30，37 ℃條件下，蛋白都可以被正常誘導(dǎo)(泳道2-4)，并且在超聲后的上清液(泳道5-7)和沉淀中(泳道8-9)都可以檢測(cè)到融合蛋白，隨后將蛋白利用GST凝膠樹脂進(jìn)行純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37 ℃條件下純化出的蛋白數(shù)量更多(泳道13)。隨后對(duì)37 ℃條件下純化出的融合蛋白利用GST抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示，pGEX-4T-1-MYB54融合蛋白可以正確的表達(dá)翻譯。

2.7 MYB54轉(zhuǎn)錄激活活性分析

MYB54作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮功能，轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制活性，為了驗(yàn)證MYB54的轉(zhuǎn)錄激活活性，利用了酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，GAL4含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-Binding domain)BD和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcription-activating domain)AD。將MYB54基因的CDS連接到pGBKT7載體上，構(gòu)建了MYB54-BD，如果MYB54蛋白具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，即使沒(méi)有與其他蛋白質(zhì)相互作用也可以啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)。將構(gòu)建好的MYB54-BD與不帶有其他表達(dá)蛋白的空AD共同轉(zhuǎn)入酵母中，在四缺培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖11所示，MYB54-BD與空AD依然能夠在四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，空AD和空BD不能在四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這一結(jié)果表明MYB54在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

M.蛋白Marker；1.蛋白誘導(dǎo)前；2-4.分別在18，30，37 ℃條件下誘導(dǎo)后的蛋白；5-7.分別在18，30，37 ℃條件下誘導(dǎo)后蛋白的超聲上清；8-10.分別在18，30，37 ℃條件下誘導(dǎo)后蛋白的超聲沉淀；11-13.分別在18，30，37 ℃條件下純化的蛋白。

M.蛋白Marker；1.GST凝膠樹脂；2.純化的GST-MYB54蛋白。M.Protein Marker；1.GST gel resin；2.Purified GST-MYB54 protein.

圖11 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)MYB54基因自激活活性Fig.11 Yeast two-hybrid system to detect the self-activating activity of MYB54 gene

3 結(jié)論與討論

MYB蛋白包含了非常保守的MYB DNA-binding結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常由至多4個(gè)重復(fù)序列(R1、R2、R3、R4)組成，植物中MYB相關(guān)蛋白通常包含2個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，即R2和R3重復(fù)序列[30]。據(jù)估計(jì)，擬南芥含有超過(guò)100個(gè)R2R3-MYB基因。功能數(shù)據(jù)表明，這些基因在次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)、細(xì)胞形狀的控制、抗病性和激素反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。對(duì)擬南芥中MYB蛋白家族的MYB54蛋白進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的MYB54蛋白與十字花科的同源性比較接近，與禾本科植物的同源性較低。MYB54蛋白在小麥和擬南芥中的保守結(jié)構(gòu)域、親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)都十分相似，因此，探明模式植物擬南芥中MYB54蛋白的功能對(duì)小麥等農(nóng)作物的研究具有重要的參考意義。MYB54基因在根、蓮座葉、莖生葉、花、果莢中均有表達(dá)，暗示該基因在植物各個(gè)部位的生長(zhǎng)發(fā)育都可能起到一定的調(diào)控作用，但在果莢中的表達(dá)量最高，因此，猜測(cè)MYB54可能在生殖發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。擬南芥和小麥中，經(jīng)過(guò)高溫處理后，MYB54的表達(dá)量都顯著降低，這也暗示著MYB54在對(duì)熱脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要功能。MYB54蛋白的誘導(dǎo)條件并不嚴(yán)格，在18，30，37 ℃溫度條件下，都可以被成功誘導(dǎo)，但在37 ℃溫度下純化的蛋白數(shù)量更多，Western Blot檢測(cè)表明MYB54蛋白可以在體外正確翻譯表達(dá)。利用酵母GAL4體系發(fā)現(xiàn)MYB54作為轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性。擬南芥MYB基因家族中依然有90%的MYB基因功能尚未被完全了解，對(duì)MYB54蛋白進(jìn)行了基礎(chǔ)的研究和初步的探索，以期為發(fā)掘更多的MYB蛋白家族功能提供理論基礎(chǔ)和參考指導(dǎo)。