朱滿喜，張玉榮，楊雅舒，楊小蘭，王創(chuàng)云，鄧 妍，趙 麗，張麗光，秦麗霞，楊利艷

(1.山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031)

氮素是植物生長的必需營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是蛋白質(zhì)、葉綠素、核苷酸和植物激素的主要成分，對植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成具有重要的作用[1-2]。近年來，為挖掘作物最大的生產(chǎn)潛力，氮肥被大量施用[3]，但氮肥的利用效率并不高，大約50%的氮肥被流失到環(huán)境中，導(dǎo)致土壤、水體和空氣受到污染，并產(chǎn)生如一氧化二氮這樣氮含量很高的溫室氣體[4]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是原產(chǎn)于南美洲安第斯地區(qū)的一年生作物，傳統(tǒng)上種植于貧瘠的土地上，對瘠薄土壤有較強(qiáng)的適應(yīng)性；同時藜麥還具有均衡的油脂、必需氨基酸、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維[5]，由于藜麥突出的全營養(yǎng)價值和對不利環(huán)境表現(xiàn)出的極強(qiáng)適應(yīng)性，2013年被宣布為國際藜麥年[6-7]，被認(rèn)為是一種對全球特別是發(fā)展中國家糧食安全有重要價值的作物[8-9]。因此，了解藜麥對氮素的利用機(jī)制將有助于提高作物對氮素的利用效率，降低環(huán)境污染，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

NIN-Like Protein(NLP)是一個植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，在響應(yīng)氮脅迫和植物氮代謝調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[10]。NIN(Nodule inception)蛋白首次發(fā)現(xiàn)于豆科植物蓮花中，是共生根瘤發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11-12]，后來發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于擬南芥、水稻[13]、甘藍(lán)型油菜[14]、小麥[15]和玉米[16]等植物中。NLP轉(zhuǎn)錄因子包含RWP-RK和PB1等2個保守結(jié)構(gòu)域，其中，RWP-RK結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，目前已發(fā)現(xiàn)，含有RWP-RK結(jié)構(gòu)域的硝酸酯酶(NIT2)是衣藻硝酸鹽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]；PB1結(jié)構(gòu)域位于羧基端，參與蛋白互作過程[18]。此外，GAF結(jié)構(gòu)域是一個普遍存在于NLP家族中的重要結(jié)構(gòu)域，在信號感知和傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[19]。對擬南芥NLP轉(zhuǎn)錄因子研究表明，NLP蛋白(AtNLP)通過與硝酸鹽反應(yīng)順式元件結(jié)合，在協(xié)調(diào)初級氮反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10，20-21]。硝酸鹽-CPK-NLP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了NLP家族在硝酸鹽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，以及NLP磷酸化在生長協(xié)調(diào)中的重要性[22]。AtNLP7與氮反應(yīng)途徑關(guān)鍵的基因ANR1、LBD37/38、NRT1.1、NRT2和NIA1結(jié)合，通過激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)氮的同化和代謝[23-24]。AtNLP8被證明是硝酸鹽促進(jìn)種子萌發(fā)的主要調(diào)節(jié)因子，可以直接與脫落酸(ABA)分解酶基因(CYP707A2)的啟動子結(jié)合，并以硝酸鹽依賴性的方式降低ABA水平[25]。目前，已經(jīng)對許多豆科植物和非豆科植物中NLP轉(zhuǎn)錄因子家族基因進(jìn)行了鑒定，但藜麥中 NLP相關(guān)信息尚未見報道。

本研究利用已公布的藜麥全基因組信息對NLP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了鑒定，并對其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、啟動子元件、蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和氮脅迫下表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在為進(jìn)一步理解藜麥NLP家族的分子進(jìn)化和生物學(xué)功能提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及氮素處理

供試藜麥品種為ZK7(Chenopodiumquinoacv. ZK7)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

用10%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，沖洗干凈后將種子置于濕潤的濾紙上，發(fā)芽后置于人工氣候培養(yǎng)箱，用Hoagland全營養(yǎng)液(N含量為7.1 mmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照 16 h，黑暗 8 h，溫度為光照23 ℃，黑暗18 ℃；待幼苗長到6～8片葉后，選取生長一致的幼苗進(jìn)行處理：低氮處理(LN). 20%N Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，N濃度為1.42 mmol/L；缺氮處理(DN). 0%N Hoagland營養(yǎng)液處理(用0.5 mol/L KCl 和 0.5 mol/L CaCl2代替KNO3和CaNO3)，N濃度為0；對照(CK). Hoagland全營養(yǎng)液處理(N濃度為7.1 mmol/L)。處理時間分別為5，30 d。每個處理設(shè) 3個生物學(xué)重復(fù)。采集的幼苗葉片立即置于液氮中速凍，超低溫保存，用于轉(zhuǎn)錄組及篩選基因的qRT-PCR分析。

1.2 藜麥NLP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的生物信息學(xué)分析

1.2.1 基因序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 藜麥基因組數(shù)據(jù)下載于藜麥全基因組數(shù)據(jù)庫ChenopodiumDB(https：//www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb/)，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由山西師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室提供，擬南芥9個NLP轉(zhuǎn)錄因子和水稻12個NLP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列分別從擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫TAIR(https：//www.arabidopsis.org/)和水稻全基因組數(shù)據(jù)庫RAP-DB(http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/)獲得。

1.2.2 藜麥NLP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的識別 從擬南芥數(shù)據(jù)庫獲得9個AtNLP基因的蛋白序列作為查詢序列，運用TBtools軟件的Blast Compare Two Seq功能在藜麥基因組中進(jìn)行BlastP比對，設(shè)E 值為10-5；將得到的藜麥蛋白序列在NCBI中再次進(jìn)行Blastp比對，去除近緣家族的成員；在CDD數(shù)據(jù)庫查詢鑒定的藜麥NLP家族成員保守結(jié)構(gòu)域，去除無NLP典型保守結(jié)構(gòu)域RWP-RK和PB1的蛋白序列。

1.2.3 藜麥NLP基因分析 利用TBtools軟件的GFF3/GTF Gene Position(info.)Parse功能，從藜麥基因組注釋文件中(Cq_PI614886_gene_V1_pseudomolecule.gff)獲得NLP基因的位置信息，提交到在線軟件MG2C(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)，用于基因染色體定位分析。運用在線服務(wù)器GSDS 2.0(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)，輸入藜麥NLP基因的全長序列和CDS序列，分析其基因結(jié)構(gòu)特征。通過TBtools的Fasta Extract功能從藜麥基因組中提取NLP基因轉(zhuǎn)錄起始位點前2 000 bp核苷酸序列作為啟動子序列，將所有的CqNLP啟動子序列提交至PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，進(jìn)行啟動子順式作用元件的預(yù)測分析。

1.2.4 藜麥NLP蛋白分析 利用在線分析軟件ExPasy(http：//au.expasy.org/tool.html)的Compute pI/MW功能分析蛋白序列的長度、分子量、等電點等理化性質(zhì)。通過BioEdit軟件的ClustalW Multiple alignment功能對保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸進(jìn)行多序列比對，在桌面版Jalview(Jalview 2.10.5)程序中對比對結(jié)果進(jìn)行編輯與可視化，在IBS軟件中繪制保守結(jié)構(gòu)域位置圖。通過MEME網(wǎng)站(http：//memesuite.org/tools/meme) 對藜麥NLP 蛋白保守基序進(jìn)行分析。參數(shù)如下：基序數(shù)目(Motif number)設(shè)置為10，基序?qū)挾?Motif width)設(shè)置為6～100。運用TBtools軟件的Gene Structure View和Batch MEME Motif Viz功能對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.5 藜麥NLP轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用BioEdit軟件的ClustalW Multiple alignment功能對藜麥、水稻和擬南芥的NLP家族蛋白序列進(jìn)行多重比對，比對結(jié)果在MEGA 7.0軟件中采用Neighbor-Joining法構(gòu)建無根進(jìn)化樹(Bootstrap=1 000)。氨基酸替代模型選擇Poisson model。

1.3 藜麥NLP基因在氮脅迫條件下的表達(dá)模式分析

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組分析 藜麥在不同氮素水平下葉片的轉(zhuǎn)錄組分析由北京百邁克生物科技有限公司完成。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中提取NLP基因家族在不同氮脅迫條件下的表達(dá)量數(shù)據(jù)，將藜麥NLP基因家族各成員的表達(dá)量FPKM值進(jìn)行l(wèi)og2(FPKM)換算后，利用TBtools軟件繪制NLP基因家族各成員的表達(dá)熱圖。

1.3.2 RNA提取及qRT-PCR分析 利用TRIzol法提取總RNA(TIANGEN 試劑盒)，用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)檢測RNA OD值(A260/280的值)。采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)進(jìn)行cDNA第1條鏈的合成。利用實時熒光定量PCR分析其在不同氮素水平下的表達(dá)特性，以各樣品的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，以EF1a作為藜麥的內(nèi)參基因。擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，39個循環(huán)。熔解程序為：60～95 ℃，每個循環(huán)增加1 ℃，持續(xù)時間為4 s；反應(yīng)體系為10.0 μL，其中，2×SYBR Green Supermix 5.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)量?；蛱禺愋砸镄蛄腥绫?所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥NLP基因家族成員鑒定及基本信息分析

以擬南芥中已鑒定好的9個NLP蛋白序列為參考，運用雙向BlastP方法獲得蛋白序列，在CDD數(shù)據(jù)庫中去除無NLP典型保守結(jié)構(gòu)域RWP-RK和PB1的蛋白序列，最終鑒定到9個藜麥NLP家族成員；根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為CqNLP1～CqNLP9(表2)，其中，CqNLP6(9 192 bp)最長，CqNLP4(3 854 bp)最短；CqNLP4的CDS序列長度最短(2 157 bp)，其他NLP基因的CDS序列長度均在2 800 bp左右。通過ExPasy網(wǎng)站分析NLP蛋白理化性質(zhì)，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，編碼的氨基酸數(shù)目為718～952個；分子質(zhì)量為80.48～104.86 ku，氨基酸數(shù)目和分子質(zhì)量均以CqNLP4最小、CqNLP8最大；等電點為5.31～6.50，均小于7，偏酸性。

表2 藜麥NLP基因家族成員基本信息Tab.2 Basic information of NLP gene family members in quinoa

2.2 藜麥NLP基因染色體定位

基于藜麥基因組注釋文件(Cq_PI614886_gene_V1_pseudomolecule.gff)進(jìn)行染色體定位，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，9 個藜麥NLP基因不均勻地分布在不同的染色體上，其中，CqNLP3、CqNLP6、CqNLP7、CqNLP8、CqNLP9分別分布于Chr10、Chr14、Chr15、Chr16、Chr17上，CqNLP1和CqNLP2分布于Chr00上，CqNLP4和CqNLP5分布于Chr13上，并且大部分藜麥NLP基因定位于染色體兩端的區(qū)域?；蚨ㄎ唤Y(jié)果顯示，CqNLP4和CqNLP5位于13號染色體末端，且距離為41 bp。有研究認(rèn)為，在染色體上距離小于50 bp的重復(fù)序列是串聯(lián)重復(fù)序列，且多分布于染色體的末端[26]。因此，預(yù)測在藜麥的NLP家族中存在串聯(lián)重復(fù)事件，即CqNLP4和CqNLP5為一對串聯(lián)重復(fù)基因。

圖1 藜麥NLP基因在染色體上的分布情況Fig.1 Distribution of CqNLPs on chromosome

2.3 藜麥NLP基因結(jié)構(gòu)分析

藜麥NLP 基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(圖2)，該基因家族成員含有4～5個外顯子、3～4個內(nèi)含子；CqNLP4和CqNLP9沒有3′UTR區(qū)，其他基因同時均具有3′UTR區(qū)和5′UTR區(qū)；另外，9個藜麥NLP基因形成了4對旁系同源基因，旁系同源基因在長度和結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性，如CqNLP5和CqNLP8為一對旁系同源基因，其基因長度僅相差53 bp，CDS長度完全相等，且同時包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，推測其具有相似的功能。

圖2 藜麥NLP家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of NLPs in quinoa

2.4 藜麥NLP啟動子分析

截取藜麥NLP基因上游2 000 bp堿基序列作為啟動子區(qū)域，提交至PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個CqNLP啟動子除了含有生長所必需的TATA-box和CAAT-box外，還存在多種應(yīng)答元件，如激素應(yīng)答元件ABRE(脫落酸)、ERE(乙烯)、P-box(赤霉素)、TCA(水楊酸)、TGA(生長素)；非生物脅迫應(yīng)答元件MBS(干旱)、ARE(低氧)、LTR(低溫)和生物脅迫應(yīng)答元件W-box(病原菌)；此外，在CqNLP3和CqNLP4的啟動子區(qū)域分別預(yù)測到1個氮素響應(yīng)元件GCN4(表3)，推測其在氮脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

表3 藜麥NLP啟動子順式作用元件分析Tab.3 Analysis of cis-acting elements of NLP promoters in quinoa

2.5 藜麥NLP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫驗證藜麥NLP蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個藜麥NLP蛋白均含有保守結(jié)構(gòu)域RWP-RK和PB1，且2個結(jié)構(gòu)域都位于蛋白序列的N端(圖3)；同時，每一對旁系同源基因的蛋白長度和保守結(jié)構(gòu)域位置都具有很高的相似性，且CqNLP4蛋白長度明顯比其他藜麥NLP蛋白短，結(jié)合其保守結(jié)構(gòu)域位置和基因結(jié)構(gòu)，推測其可能在進(jìn)化過程中發(fā)生5′端缺失突變。

圖3 藜麥NLP蛋白保守結(jié)構(gòu)域位置Fig.3 Conserved domain location of CqNLP proteins

將藜麥NLP蛋白RWP-RK和PB1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，進(jìn)一步分析2個結(jié)構(gòu)域的保守性發(fā)現(xiàn)(圖4)，RWP-RK結(jié)構(gòu)域由43～49個氨基酸組成，PB1結(jié)構(gòu)域由61～81個氨基酸組成，且2個結(jié)構(gòu)域中均存在多個氨基酸保守位點，尤其在RWP-RK結(jié)構(gòu)域中只有極個別位點保守性較差，推測這些保守位點在NLP蛋白行使功能過程中發(fā)揮重要作用。CqNLP4蛋白的2個保守結(jié)構(gòu)域較其他NLP蛋白保守性差，均出現(xiàn)3′缺失現(xiàn)象，結(jié)合對CqNLP4蛋白的分析，推測其在進(jìn)化的過程中可能出現(xiàn)了新的功能。

2.6 藜麥NLP蛋白保守基序分析

對9個藜麥NLP蛋白保守基序的位置和序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5-A所示，共發(fā)現(xiàn)10個Motif，在藜麥NLP蛋白家族每個成員中均存在，依次命名為Motif1～Motif10；通過CDD數(shù)據(jù)庫驗證，Motif1對應(yīng)RWP-RK結(jié)構(gòu)域，Motif5和Motif9對應(yīng)PB1結(jié)構(gòu)域。

由圖5-B可知，Motif1、Motif5和Motif9的氨基酸序列比其他基序的保守性高，與結(jié)構(gòu)域的保守性一致；此外，Motif1中存在RWP-RK結(jié)構(gòu)域的特征氨基酸序列組成“RWPSRK”，但只有在CqNLP4中缺失2個氨基酸位點，一致性較差，該結(jié)果進(jìn)一步印證了對保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果。

2.7 藜麥、擬南芥和水稻NLP家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究用藜麥和已經(jīng)鑒定的擬南芥、水稻全部NLP 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對藜麥NLP家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，OsNLP6由于RWP-RK保守結(jié)構(gòu)域缺失被分到外類群，其余29個NLP蛋白被明顯分為3組，分別命名為Class Ⅰ、ClassⅡ和ClassⅢ；在藜麥NLP蛋白中，CqNLP2和CqNLP3屬于Class Ⅰ組，CqNLP7和CqNLP9歸到ClassⅡ組，CqNLP1、CqNLP4、CqNLP5、CqNLP6和CqNLP8聚到Class Ⅲ組。通過對3個物種NLP蛋白的同源性進(jìn)行分析，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)了10對物種內(nèi)的旁系同源基因，沒有發(fā)現(xiàn)物種間的直系同源基因，表明這3個物種的NLP家族在進(jìn)化過程中按照各自物種的特性進(jìn)行了分化，以更好地適應(yīng)環(huán)境，這種現(xiàn)象普遍存在于各種植物中。CqNLP4、CqNLP5、CqNLP8與AtNLP7的親緣關(guān)系最近。

圖4 藜麥NLP蛋白保守結(jié)構(gòu)域多序列比對Fig.4 Multiple sequences alignment of conserved domain of NLP proteins

圖5 藜麥NLP蛋白Motif分析Fig.5 Motif analysis of NLP proteins in quinoa

圓表示擬南芥NLP蛋白；三角形表示水稻NLP蛋白；正方形表示藜麥NLP蛋白。The circle represents the Arabidopsis NLP protein; The triangle represents riceNLP protein;The square represents the Chenopodium quinoa NLP protein.

2.8 藜麥NLP基因家族在氮素脅迫下的表達(dá)分析

以山西師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室已有的藜麥品種ZK7不同氮素水平處理下的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，提取NLP基因家族表達(dá)數(shù)據(jù)，將不同樣品的FPKM值進(jìn)行l(wèi)og2(FPKM)標(biāo)準(zhǔn)化處理后繪制藜麥NLP基因家族成員的表達(dá)熱圖，結(jié)果顯示(圖7)，9個藜麥NLP基因在不同氮素水平處理時間(5，30 d)、不同處理濃度(CK、LN和DN)均有表達(dá)；整體來看，處理組(LN和DN)的表達(dá)量高于對照組(CK)，且LN組的表達(dá)量高于DN組，處理30 d的表達(dá)量明顯高于處理5 d的表達(dá)量。

圖7 藜麥NLP基因在不同氮素水平處理下的表達(dá)熱圖Fig.7 Expression heat map of quinoa NLPs geneunder different nitrogen levels

為進(jìn)一步明確氮脅迫下藜麥NLP基因的表達(dá)模式，從表達(dá)圖譜中選取表達(dá)量明顯高于其他家族成員的CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5、CqNLP8、CqNLP9進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，結(jié)果表明(圖8)，藜麥NLP基因表達(dá)量受不同氮素水平的誘導(dǎo)發(fā)生變化；總體上，處理后期(30 d)藜麥NLP基因的表達(dá)量高于前期(5 d)，其中，CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5、和CqNLP8表達(dá)趨勢基本一致，在不同氮素水平處理前期(5 d)，CqNLP2在低氮處理(LN)時表達(dá)量顯著增加，CqNLP3、CqNLP5、CqNLP8相對表達(dá)量的變化不顯著；后期(30 d) 達(dá)量發(fā)生顯著變化；低氮處理(LN)顯著上調(diào)，缺氮處理(DN)顯著下調(diào)，以CqNLP5變化最為顯著，與對照相比，其在低氮處理組表達(dá)上調(diào)74.1%，缺氮處理組表達(dá)下調(diào)59.5%；CqNLP9的表達(dá)模式較為特殊，在處理后期(30 d)，不同氮脅迫程度下表達(dá)量均有增加，與CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5和CqNLP8的表達(dá)趨勢明顯不同(低氮上調(diào)、缺氮下調(diào))，尤其低氮處理后期CqNLP9的表達(dá)量急劇增加，為對照組的23.6倍。實時熒光定量PCR 分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)熱圖分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)上游的重要調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育[27]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]和逆境響應(yīng)[20，29]方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中，研究較多的有WRKY[30-31]、NAC[32]、MYB[33]、bZIP[34]等，有關(guān)NLP轉(zhuǎn)錄因子功能在擬南芥和豆科植物中有少量報道，對藜麥NLP的功能研究尚未見報道。

字母 a、 b、 c表示不同樣本之間存在顯著差異(P<0.05)。a，b，and c showed significant difference between different samples(P<0.05).

本研究對藜麥NLP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了鑒定，在藜麥全基因組中分析發(fā)現(xiàn)了9個NLP家族成員，與擬南芥NLP家族成員數(shù)目相同[13]，相比水稻中有6個NLP家族成員[35]、高粱中有5個NLP家族成員，藜麥NLP家族成員的功能可能更多樣化，但藜麥基因組(1.39 Gb)具有與小基因組擬南芥(135 Mb)相同數(shù)量的NLP家族成員，表明NLP家族在進(jìn)化上的保守性及其對維持植物正常生長發(fā)育的重要性。為研究CqNLP基因的功能，本研究對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CqNLP含有不同數(shù)目的外顯子和內(nèi)含子，大多數(shù)CqNLP含有UTR區(qū)，只有CqNLP4和CqNLP9沒有3′UTR區(qū)，主要基因結(jié)構(gòu)是5個外顯子和4個內(nèi)含子，表明基因結(jié)構(gòu)具有多樣性且與其他物種的NLP基因結(jié)構(gòu)相似[16，36]。CqNLP基因結(jié)構(gòu)的差異是由內(nèi)含子的變化引起的，基因結(jié)構(gòu)的不同狀態(tài)可能與CqNLP基因的進(jìn)化有關(guān)，有助于進(jìn)化基因選擇新的功能，提高植物對環(huán)境的適應(yīng)性。植物啟動子主要包括一些特異性的順式作用元件，通過與多種調(diào)控因子結(jié)合決定基因的表達(dá)模式和強(qiáng)度。通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)，藜麥NLP家族基因的啟動子區(qū)除了包含生長必需的元件外，還存在多種脅迫應(yīng)答元件，其中，在CqNLP3和CqNLP4的啟動子中各發(fā)現(xiàn)了1個氮素響應(yīng)元件GCN4，該響應(yīng)元件在蘋果[37]、小麥[15]中也有發(fā)現(xiàn)，推測其可能在藜麥氮脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮作用，并具有一定的保守性。蛋白序列分析及保守結(jié)構(gòu)域比對發(fā)現(xiàn)，藜麥NLP家族成員均具有RWP-RK和PB1保守結(jié)構(gòu)域，其中，RWP-RK包括一個“螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[13]，這一結(jié)構(gòu)是NLP轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用的關(guān)鍵結(jié)合位點，能夠激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄；PB1結(jié)構(gòu)域是一個蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，能夠在含有PB1結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)之間進(jìn)行異源二聚反應(yīng)[38]，NIN和NLP通過其羧基末端的PB1結(jié)構(gòu)域進(jìn)行物理相互作用，觸發(fā)NLP從胞漿到細(xì)胞核的重新定位，抑制NIN激活CRE1的表達(dá)，在硝酸鹽抑制共生結(jié)瘤過程中發(fā)揮核心作用[39]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，藜麥NLP家族被分為3組，這與前人的研究結(jié)果一致[13]，藜麥和擬南芥的NLP家族成員存在于各個分支，水稻的NLP家族成員只存在Class Ⅰ和Class Ⅲ組中，并且藜麥與擬南芥NLP轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系比水稻更近，說明NLP基因家族的分化在單子葉植物水稻分化之前。CqNLP4、CqNLP5、CqNLP8與AtNLP7親緣關(guān)系最近。前人研究表明，AtNLP7通過與氮反應(yīng)途徑的關(guān)鍵基因結(jié)合來調(diào)節(jié)氮的同化和代謝[24-25]，推測這3個轉(zhuǎn)錄因子在藜麥氮代謝途徑中可能起重要調(diào)控作用。

NLP轉(zhuǎn)錄因子是植物非生物脅迫響應(yīng)過程的重要調(diào)控因子。前人研究表明，擬南芥AtNLP7突變體表現(xiàn)出葉片失水減少和對干旱脅迫的耐受性[20]，但具體機(jī)制尚不明確。蘋果MdNLP5啟動子中存在一個響應(yīng)氮的GCN4作用元件，說明該類轉(zhuǎn)錄因子與氮素有密不可分的關(guān)系[37]。本研究分析了氮脅迫下藜麥NLP家族基因的表達(dá)情況，氮脅迫處理前期(5 d)藜麥NLP基因表達(dá)無明顯變化，這可能與取材部位有關(guān)，本試驗取材于藜麥葉片，氮素經(jīng)吸收和轉(zhuǎn)運，最后作用于葉片存在一定的延時；處理后期(30 d)隨著氮脅迫程度的加深藜麥NLP基因表達(dá)量先升高后降低，此時藜麥葉片對氮素的變化做出響應(yīng)，NLP基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中，低氮處理后期CqNLP9的表達(dá)量急劇增加，后期可作為響應(yīng)氮脅迫候選基因?qū)ζ涔δ苓M(jìn)一步驗證。

本研究結(jié)果表明，在藜麥全基因組中共鑒定出9個NLP基因家族成員，不均勻地分布在7條染色體上；系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ共3組，成員均具有典型保守結(jié)構(gòu)域RWP-RK和PB1；啟動子區(qū)包含多種激素和脅迫應(yīng)答順式作用元件；氮素脅迫處理前期除CqNLP2外各基因表達(dá)量無顯著變化，脅迫處理后期CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5和CqNLP8的表達(dá)量顯著變化(低氮上調(diào)、缺氮下調(diào))，CqNLP9受低氮顯著誘導(dǎo)表達(dá)。本研究結(jié)果可為后續(xù)CqNLPs基因克隆和氮素脅迫分析提供一定參考依據(jù)。