周 婷，岳彩鵬，黃進(jìn)勇，華營(yíng)鵬

(鄭州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為冬油菜品種湘油15，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)官春云院士提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘藍(lán)型油菜AMT家族基因的鑒定 利用擬南芥AMT氨基酸序列為種子序列進(jìn)行Blast分析，在白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜等植物中尋找AMT基因。在本研究中，使用了以下數(shù)據(jù)庫(kù)：擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR)(https：//www.arabidopsis.org/)用于擬南芥氨基酸序列查找，蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)(BRAD)v.1.1(http：//brassicadb.org/brad/)[32]用于白菜、甘藍(lán)以及甘藍(lán)型油菜氨基酸序列搜索。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蕓薹屬植物中的基因進(jìn)行了命名：種名+染色體+同源基因的名稱。例如，BnaA1.AMT1；4是指甘藍(lán)型油菜A1染色體上擬南芥AMT1；4的同源基因。

1.2.2 AMT蛋白的分子特性鑒定 使用ExPASy ProtoParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)[33]計(jì)算了各AMT蛋白的氨基酸數(shù)目和組成、分子質(zhì)量(MW)、理論等電點(diǎn)(pI)、平均親水系數(shù)(GRAVY)和不穩(wěn)定性指數(shù)。利用THMMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)[34]預(yù)測(cè)氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)數(shù)目。

1.2.3 AMT家族基因進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 利用MEGA 7中的ClustalW功能，對(duì)20個(gè)甘藍(lán)型油菜AMT蛋白序列、6個(gè)擬南芥AMT蛋白序列、9個(gè)白菜AMT蛋白序列和10個(gè)甘藍(lán)的AMT蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果，采用鄰近法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)定為1 000[35-36]。

1.2.4 AMT家族基因的結(jié)構(gòu)分析 為了研究擬南芥和蕓薹屬作物AMT蛋白的結(jié)構(gòu)差異，將所有的AMT蛋白序列置于MEME v5.1.1[37](http://meme-suite.org/tools/meme)中比對(duì)，以表征保守結(jié)構(gòu)域。除了下列參數(shù)外，其余參數(shù)使用默認(rèn)設(shè)置：最佳圖案寬度設(shè)置為6～50 bp，最大保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量設(shè)置為10。使用2種不同的工具分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：GOR4[38](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/page=npsagor4.html/)和PSIPRED[39](http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/PSIPRED/)。利用在線網(wǎng)站Phyre2[40](http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)進(jìn)行同源建模，以構(gòu)建蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

1.2.5 AMT家族基因的染色體定位分析 為了確定AMT基因在染色體上的位置和方向，將完整的AMT基因核苷酸序列進(jìn)行BlastTn搜索，從而確定了AMT基因在每個(gè)染色體上的起始位置。使用MapInspect v.2010(http://www.soft.com/./MapInspect.html)作圖，描繪AMT基因的基因組位置。串聯(lián)重復(fù)基因是指100 kb基因組區(qū)域內(nèi)的2個(gè)或更多基因的陣列[41]。

1.2.7 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 對(duì)上述脅迫處理(1.2.6)的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000，每個(gè)樣品生成6.0 Gb測(cè)序數(shù)據(jù)，測(cè)序方式為雙末端(PE)測(cè)序，讀取長(zhǎng)度為150 bp。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05和表達(dá)變化倍數(shù)≥2為鑒定差異表達(dá)基因的閾值。

1.2.8 組織表達(dá)分析 組織表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)(BnTIR，http：//yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR)。數(shù)據(jù)包括甘藍(lán)型油菜中雙11的90個(gè)不同樣品，覆蓋了油菜生長(zhǎng)過(guò)程不同階段的不同器官。利用GraphPad Prism軟件繪制箱型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體白菜與甘藍(lán)以及四倍體甘藍(lán)型油菜AMT家族基因的鑒定

為了鑒定甘藍(lán)型油菜中的AMT基因，使用擬南芥AMT的氨基酸序列作為參照，從蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)(BRAD)中提取基因，并用油菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢驗(yàn)這些基因的注釋。進(jìn)一步用SMART[43]軟件對(duì)所有潛在基因所編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行校驗(yàn)，以保證每個(gè)蛋白質(zhì)中都含有完整的AMT保守結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過(guò)篩選，最終鑒定出20個(gè)BnaAMT基因：其中14個(gè)為AMT1家族成員：3個(gè)BnaAMT1;1s，2個(gè)BnaAMT1;2s、3個(gè)BnaAMT1;3s、3個(gè)BnaAMT1;4s、3個(gè)BnaAMT1;5s，其余6個(gè)為AMT2亞家族成員BnaAMT2;1s；并基于蕓薹屬植物基因命名標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了命名：BnaA5.AMT1；1～BnaCnn.AMT2；1。其中，Cnn表示該基因錨在C亞基因組上，但具體染色體信息未知；Unn表示該基因在油菜基因組的染色體信息完全未知。用同樣的方法找到了白菜和甘藍(lán)的AMT家族基因，白菜中共有9個(gè)AMT成員，甘藍(lán)中共有10個(gè)AMT成員。分析了這39個(gè)基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)以及平均親水系數(shù)。所有AMT基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量為330～669，其中33個(gè)介于475～512，差異較小(表1)。不穩(wěn)定性指數(shù)>40表明蛋白質(zhì)不穩(wěn)定[44]，分析表明這39個(gè)AMT蛋白均為穩(wěn)定蛋白。

表 1 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)AMT家族基因信息Tab.1 Basic information of AMT family genes in Brassica napus，Brassica rapa and Brassica oleracea

2.2 AMT家族基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用20個(gè)甘藍(lán)型油菜BnaAMTs蛋白序列、9個(gè)白菜BraAMTs蛋白序列、10個(gè)甘藍(lán)BolAMTs蛋白序列和6個(gè)擬南芥AtAMTs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。AMT的每個(gè)亞家族成員都與擬南芥中的相應(yīng)同源基因緊密聚集(圖1)，暗示甘藍(lán)型油菜AMT家族基因與擬南芥相應(yīng)同源基因具有相似功能。同時(shí)，甘藍(lán)型油菜BnaAMTs均與白菜或者甘藍(lán)的AMT成簇出現(xiàn)，擬南芥單獨(dú)成一個(gè)分支(圖1)，這說(shuō)明甘藍(lán)型油菜與白菜和甘藍(lán)基因編碼的蛋白質(zhì)在序列上的相似程度高于擬南芥，親緣關(guān)系更近。

2.3 AMT家族基因的染色體定位

通過(guò)下載甘藍(lán)型油菜AMT基因相關(guān)染色體定位信息，利用軟件MapInspect進(jìn)行染色體定位并進(jìn)行可視化分析(圖2)。結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜的20個(gè)AMT基因不均勻地分布在12條染色體上：C4染色體上分布3個(gè)(BnaC4.AMT2；1a、BnaC4.AMT2；1b、BnaC4.AMT2；1c)，A1、A5和C3染色體上均分布2個(gè)(BnaA1.AMT1；3、BnaA1.AMT1；4、BnaA5.AMT1；1、BnaA5.AMT2；1、BnaC3.AMT1；5a、BnaC3.AMT1；5b)，A4、A7、A9、C1、C6、C7和C8染色體上均分布1個(gè)AMT基因(分別是：BnaA4.AMT2；1、BnaA7.AMT1；3、BnaA9.AMT1；2、BnaC1.AMT1；4、BnaC6.AMT1；1、BnaC7.AMT1；4、BnaC8.AMT1；1)。BnaCnn.AMT1；2(僅知定位在C亞基因組，具體染色體信息未知)、BnaUnn.AMT1；3(所在亞基因組和染色體信息未知)和BnaCnn.AMT2；1(僅知定位在C亞基因組，具體染色體信息未知)由于具體位置不詳，無(wú)法進(jìn)行染色體定位。其中，BnaC4.AMT2；1b和BnaC4.AMT2；1c在染色體上的相對(duì)位置僅為4 412 bp，推斷它們?yōu)榇?lián)重復(fù)基因簇。

圖1 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥AMT家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of AMT proteins in Brassica napus， Brassica rapa， Brassica oleracea and Arabidopsis

圖2 甘藍(lán)型油菜AMT家族基因在染色體上的分布Fig.2 Chromosomal location of Brassica napus AMT family genes

2.4 多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析

從分子進(jìn)化的角度來(lái)看，如果氨基酸殘基進(jìn)化保守，則認(rèn)為它們?cè)诠δ苌匣蚪Y(jié)構(gòu)上具有重要意義。序列同源性分析表明，甘藍(lán)型油菜與擬南芥AMT蛋白具有高度相似性，表明AMT在異源多倍化過(guò)程中是保守的。為了揭示蕓薹屬植物和擬南芥AMT家族基因之間的內(nèi)在聯(lián)系，將45個(gè)AMT基因的氨基酸序列提交到MEME網(wǎng)站進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)和注釋。MEME分析表明，BnaAMT家族基因編碼的氨基酸序列在蕓薹屬植物中基本含有相同的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，表明它們高度保守。Motif是蛋白質(zhì)分子中具有特定空間構(gòu)象和特定功能的結(jié)構(gòu)成分。它是結(jié)構(gòu)域的亞單位，與特定的功能有關(guān)，推測(cè)具有不同Motif的AMT成員可能在進(jìn)化和功能上存在差異。如，所有的BnaAMT2；1s基因均沒(méi)有Motif1、Motif5和Motif6(圖3)，這可能是AMT2家族功能不同于AMT1家族的結(jié)構(gòu)上的原因。AMT1和AMT2亞家族結(jié)構(gòu)差異巨大，進(jìn)化的過(guò)程中可能分開(kāi)較早。

圖3 甘藍(lán)型油菜AMT家族基因及保守基序分析Fig.3 Diagram of structure of Brassica napus AMT family genes and their conserved Motifs

2.5 AMT家族蛋白的二級(jí)與三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

BnaAMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)見(jiàn)圖4。由于多重序列比對(duì)顯示，AMT1亞家族和AMT2亞家族序列差異較大(圖3)，分別以BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1為例進(jìn)行了二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。GOR4和PSIPRED的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相似。AMT家族主要由α-螺旋、延伸鏈與隨機(jī)螺旋構(gòu)成，AMT1家族α螺旋比例高于AMT2家族，而AMT2家族的延伸鏈與隨機(jī)螺旋比例高于AMT1家族(圖4)。3D輪廓突出了AMT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，可以直觀看出AMT蛋白結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、延伸鏈與隨機(jī)螺旋(圖5)。這些結(jié)果表明，隨機(jī)螺旋和α-螺旋是這些AMT蛋白結(jié)構(gòu)的重要組成部分。

2.6 BnaAMT基因的表達(dá)特性分析

2.6.1 BnaAMT基因的組織特異性表達(dá) 通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組信息資源庫(kù)中AMT基因的分析，得到17個(gè)AMT基因(缺少BnaC3.AMT1；5b、BnaC4.AMT2；1c和BnaCnn.AMT2；1基因，在BnPIR(http：//cbi.hzau.edu.cn/bnapus/)甘藍(lán)型油菜泛基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)，這些基因在中雙11油菜基因組中缺失)在8個(gè)組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，不同基因在甘藍(lán)型油菜不同器官的表達(dá)存在差異，進(jìn)化樹(shù)中處于同一分支的基因表達(dá)情況相似。例如，BnaA5.AMT1；1和BnaC6.AMT1；1基因在甘藍(lán)型油菜除籽粒外的其他器官中表達(dá)量都相對(duì)較高，而BnaC8.AMT1；1基因在甘藍(lán)型油菜所有器官都處于低表達(dá)狀態(tài)(圖 6)。根器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA7.AMT1；3和BnaC3.AMT1；5a；莖器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA1.AMT1；4和BnaC7.AMT1；4；葉器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4和BnaA5.AMT2；1；蕾器官中表達(dá)較高的基因有BnaA1.AMT1；4、BnaC1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4和BnaC4.AMT2；1b；花器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4、BnaC1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4、BraA3.AMT1；5和BnaC4.AMT2；1b；角果器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4和BnaC7.AMT1；4；角果殼器官中表達(dá)較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4、BnaA5.AMT2；1和BnaC4.AMT2；1b，籽粒中所有基因均呈低表達(dá)狀態(tài)(圖 6)。

圖4 甘藍(lán)型油菜BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Secondary structure analysis of BnaA5.AMT1；1 and BnaA4.AMT2；1 proteins

圖5 甘藍(lán)型油菜BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of three-dimensional structure of BnaA5.AMT1；1 and BnaA4.AMT2；1 proteins

圖6 甘藍(lán)型油菜AMT家族基因在不同組織中的表達(dá)情況Fig.6 The expression of BnaAMT family genes in different tissues

S.地上部；R.根；差異顯著性分析采用單因素方差分析，Tukey檢驗(yàn)，圖中不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。圖8同。S.Shoot；R.Root；The significance of difference was evaluated using one-way ANOVA，Tukey test，different letters in the same group indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same as Fig.8.

2.6.3 BnaAMT對(duì)其他非生物脅迫的響應(yīng) 隨后，進(jìn)一步分析了甘藍(lán)型油菜AMT家族基因?qū)ζ渌麪I(yíng)養(yǎng)脅迫與重金屬脅迫，以及鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)情況，其中包括磷脅迫(缺磷)、硼脅迫(缺硼)、鎘脅迫(鎘毒害)以及鹽脅迫(鹽毒害)。在缺磷條件下，BnaC6.AMT1；1和BnaA9.AMT1；2在油菜地上部和根系中的表達(dá)量均顯著上升，地上部BnaA7.AMT1；3、BnaA5.AMT2；1和BnaC4.AMT2；1c表達(dá)量顯著上升，只有BnaC7.AMT1；4表達(dá)量顯著下降，其他基因的表達(dá)量無(wú)顯著變化(圖8-A)。在缺硼條件下，根系中的BnaAMT1s 3個(gè)成員的表達(dá)水平均顯著上升；地上部BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2的表達(dá)量顯著上升，只有BnaC7.AMT1；4表達(dá)量顯著下降(圖8-B)。無(wú)論根部還是地上部，鎘毒對(duì)AMT家族基因的表達(dá)影響較小(圖8-C)。油菜受到鹽脅迫時(shí)，地上部BnaA9.AMT1；2和BnaC4.AMT2；1c表達(dá)量顯著上升，BnaC4.AMT2；1和BnaCnn.AMT2；1表達(dá)量顯著下降，其他基因表達(dá)無(wú)顯著變化；根部AMT家族基因整體上則呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(圖8-D)?？傊?，甘藍(lán)型油菜在遭受缺硼或者缺磷脅迫時(shí)，AMT家族部分基因呈現(xiàn)上升表達(dá)趨勢(shì)；在鹽脅迫條件下，根系A(chǔ)MT家族基因整體表達(dá)量下降；鎘毒對(duì)AMT家族基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。

圖8 磷、硼、鎘、鹽脅迫下甘藍(lán)型油菜BnaAMT家族基因的轉(zhuǎn)錄組分析Fig.8 Transcriptome responses of BnaAMT family genes to phosphorus，boron，cadmium and salt stresses

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在甘藍(lán)型油菜全基因組中發(fā)現(xiàn)了20個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可分為2個(gè)亞家族。其中14個(gè)為AMT1家族成員，其余6個(gè)為AMT2亞家族成員。由保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果可知，甘藍(lán)型油菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族內(nèi)的蛋白質(zhì)序列保守性強(qiáng)，但亞家族間的差異較大。油菜在進(jìn)化過(guò)程中，基因組發(fā)生了多次多倍化事件進(jìn)而導(dǎo)致油菜內(nèi)部普遍存在多拷貝基因家族[26-27]，類似作物包括小麥(TriticumaestivumL.)[46]和棉花 (GossypiumhirsutumL.)[47]。因此，擬南芥中的每個(gè)基因在油菜中應(yīng)有6個(gè)拷貝[48]。一個(gè)基因的多個(gè)拷貝的存在釋放了任何單個(gè)拷貝以及自然和人為的選擇壓力，這促進(jìn)了新基因功能的出現(xiàn)[49]。由此產(chǎn)生的變異的增加可以用于培育具有理想表型的作物品種[50]。因此，異源四倍體油菜AMT家族成員是否具有不同于擬南芥的新基因功能還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究在甘藍(lán)型油菜基因組中共發(fā)現(xiàn)了20個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中14個(gè)為AMT1亞家族成員，6個(gè)為AMT2亞家族成員。由保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果可知，銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族內(nèi)的蛋白質(zhì)序列保守性強(qiáng)，但亞家族之間的差異較大。甘藍(lán)型油菜AMT基因與模式植物擬南芥AMT的同源基因的表達(dá)模式既有相似之處，又存在差異。這表明在基因組多倍化過(guò)程中，AMT基因發(fā)生了功能分化，產(chǎn)生了適應(yīng)油菜的新的基因功能。根部BnaA5.AMT1；1和BnaA7.AMT1；3，葉片BnaC7.AMT1；4和BnaA5.AMT2；1，角果殼BnaA5.AMT2；1表達(dá)量高，同時(shí)對(duì)不同氮水平響應(yīng)顯著，可以利用這些基因進(jìn)行遺傳操作以培育具有理想表型的油菜品種。在缺硼或者缺磷脅迫時(shí)，BnaAMT家族部分基因呈現(xiàn)上升表達(dá)的趨勢(shì)；在鹽毒害脅迫下，根系A(chǔ)MT家族基因整體表達(dá)量下降；鎘毒對(duì)AMT家族基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入解析甘藍(lán)型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基礎(chǔ)。