亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        黃芩苷改善慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知障礙的作用及機(jī)制研究

        2021-09-01 03:13:50陳景楊磊左亞杰張琴彭詞艷湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑部長(zhǎng)沙40007中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部長(zhǎng)沙400
        中南藥學(xué) 2021年7期
        關(guān)鍵詞:黃芩海馬批號(hào)

        陳景,楊磊,左亞杰,張琴,彭詞艷(.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑部,長(zhǎng)沙 40007;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)沙 400)

        慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)又稱為慢性腦缺血,它是指由各種原因引發(fā)的長(zhǎng)期腦血流灌注不足。CCH 可導(dǎo)致腦關(guān)鍵部位(尤其是海馬CA1 區(qū))缺血缺氧,誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元損害,進(jìn)而引起認(rèn)知障礙[1]。因此,CCH被認(rèn)為是造成血管性癡呆(vascular dementia,VaD)的一個(gè)主要誘因[2]。VaD 是繼阿爾茨海默癥之后最常見(jiàn)的一種癡呆類型,目前尚無(wú)有效的治療藥物[3]。借助CCH 模型,大量研究對(duì)VaD 的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行了探討,但其詳細(xì)機(jī)制仍未完全闡明。因此,通過(guò)CCH 模型研究VaD 的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療藥物仍是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

        黃芩苷是從黃芩干燥根中提取分離出來(lái)的一種黃酮類化合物,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯示出多種藥理活性[4]。動(dòng)物研究顯示黃芩苷對(duì)局灶性腦缺血損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制主要是通過(guò)抗氧化實(shí)現(xiàn)的[5]。然而,黃芩苷能否改善CCH 所致的認(rèn)知損傷,以及其所涉及的分子機(jī)制,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究擬觀察黃芩苷對(duì)CCH 所致認(rèn)知障礙的作用,并探討其機(jī)制,從而為VaD 的臨床治療提供可靠依據(jù)。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物

        SD 雄性大鼠90 只,體質(zhì)量180~200 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002,質(zhì)量合格證號(hào):43004700042552]。大鼠自由飲水?dāng)z食,隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃,光照遵循明暗交替12/12 h 的節(jié)律。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循國(guó)際衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)關(guān)于動(dòng)物使用倫理學(xué)方面的原則。

        1.2 試藥及儀器

        黃芩苷(批號(hào):021608102,Sigma 公司,純度≥95%)。水合氯醛(批號(hào):20170302,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),烏拉坦(批號(hào):51-79-6,上海山浦化工有限公司)。神經(jīng)元核(NeuN)抗體(批號(hào):ab177487)、突觸素(SYP)抗體(批號(hào):ab32127)(Abcam 公司),磷酸化核因子E2相關(guān)因子2(p-Nrf2)抗體(批號(hào):LM-2013R,上海聯(lián)邁生物工程有限公司),血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體(批號(hào):10701-1-AP,Proteintech),內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號(hào):cw0100,Cwbiotech 公司)。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄分析系統(tǒng)(MT-200,成都泰盟科技有限公司),電生理在體場(chǎng)電位記錄分析系統(tǒng)(RM6240BD,成都儀器廠),凝膠電泳儀(DYY-8C,北京六一儀器廠)。其余試劑均為市售分析純。

        2 方法

        2.1 CCH 模型建立

        采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)建立大鼠CCH模型。術(shù)前大鼠禁食12 h,禁食后大鼠腹腔注射350 mg·kg-1水合氯醛麻醉,小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,剝離迷走神經(jīng)。用手術(shù)線分別在雙側(cè)頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端與近心端進(jìn)行雙結(jié)扎,將兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間血管剪斷。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎和剪斷血管,其他操作同上。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持大鼠體溫在36~38℃。手術(shù)過(guò)程中,大鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈血管被剪斷,故最終納入觀察的大鼠均默認(rèn)為缺血成功。

        2.2 動(dòng)物分組及給藥

        18 只大鼠在雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎造模后死亡。剩余大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組,即假手術(shù)組、模型組、缺血+黃芩苷低劑量組(50 mg·kg-1)、缺血+黃芩苷中劑量組(100 mg·kg-1)、缺血+黃芩苷高劑量組(200 mg·kg-1)、假手術(shù)+黃芩苷組(100 mg·kg-1),每組12 只。黃芩苷溶液用生理鹽水配制,于造模1 周后開(kāi)始灌胃給藥,給藥劑量參考文獻(xiàn)方法[6],每日一次,持續(xù)給藥2 周。

        2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

        在造模后的第14~19日采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。將大鼠置于水迷宮中進(jìn)行連續(xù)5 d 的定位航行訓(xùn)練讓其尋找平臺(tái),每日4 次,每次間隔約10 min。每次實(shí)驗(yàn)大鼠共游泳60 s 來(lái)尋找隱藏的平臺(tái),若大鼠在60 s 內(nèi)找到平臺(tái),記錄該時(shí)間為逃逸潛伏期,并讓其在平臺(tái)上停留10 s;若大鼠在60 s 未找到平臺(tái),其逃逸潛伏期默認(rèn)為60 s,并人工誘導(dǎo)大鼠至平臺(tái)上停留10 s。于第6日將平臺(tái)移去進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn),記錄大鼠60 s 內(nèi)在目標(biāo)象限所待的時(shí)間。逃逸潛伏期用以評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)能力,目標(biāo)象限所待時(shí)間用以評(píng)價(jià)大鼠的記憶功能。

        2.4 新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)

        在造模后的第20日采用新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)開(kāi)口木制敞箱(50 cm×50 cm×90 cm)組成。在實(shí)驗(yàn)前一日,將大鼠放置木箱中探索5 min 以適應(yīng)環(huán)境。第2日為正式實(shí)驗(yàn),由間隔1 h 的兩個(gè)階段組成。第一階段,將一個(gè)棕色木制正方體(邊長(zhǎng)5 cm)與黑色橡膠圓錐體(底面直徑5 cm,高5 cm)分別放置敞箱的兩個(gè)對(duì)角。將大鼠從敞箱中間位置放入,讓其自由探索兩個(gè)物體。探索行為定義為:大鼠鼻尖接觸物體或鼻尖指向物體且距離小于1 cm。第一階段實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)大鼠累積探索時(shí)間達(dá)到20 s 時(shí),將大鼠取出。在第二階段實(shí)驗(yàn),將黑色橡膠圓錐體(舊事物)換成一個(gè)直徑5 cm 的藍(lán)色玻璃球(新事物),記錄5 min 內(nèi)大鼠探索兩個(gè)物品各自的時(shí)間。數(shù)據(jù)分析采用分辨指數(shù)對(duì)各組大鼠進(jìn)行比較。分辨指數(shù)=(探索新事物的時(shí)間-探索舊事物的時(shí)間)/(探索新事物的時(shí)間+探索舊事物的時(shí)間)。

        2.5 電生理長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)記錄

        新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)后的第2日,大鼠用1.5 g·kg-1烏拉坦腹腔注射麻醉后進(jìn)行海馬Schaffer側(cè)枝-CA1 區(qū)LTP 的記錄。刺激電極定位:前囟后3.7 mm;旁開(kāi)3.2 mm;硬膜下2.0 mm;記錄電極定位:前囟后3.3 mm;旁開(kāi)2.2 mm;硬膜下1.8 mm。選擇誘發(fā)最大興奮性突觸后電位(EPSPs)幅度40%所對(duì)應(yīng)的電壓強(qiáng)度作為基礎(chǔ)刺激,刺激間隔30 s,頻率0.3 Hz。記錄基線20 min 后,采用高頻高強(qiáng)刺激誘導(dǎo)LTP,參數(shù)為:連續(xù)4 串脈沖,每串脈沖間隔5 min,每串脈沖持續(xù)1 s,頻率100 Hz;刺激強(qiáng)度為最大EPSPs 幅度80%所對(duì)應(yīng)的電壓強(qiáng)度。高頻高強(qiáng)刺激后休息5 min,然后將刺激參數(shù)調(diào)為與基礎(chǔ)刺激一致,繼續(xù)記錄1 h。將高頻高強(qiáng)誘導(dǎo)后的EPSPs 平均值與誘導(dǎo)前基線平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,比較標(biāo)準(zhǔn)化后各組間誘導(dǎo)后的平均值。

        2.6 大鼠海馬CA1 區(qū)NeuN 及SYP 的表達(dá)

        大鼠LTP 記錄完成后,立馬斷頭取腦分離出海馬CA1 區(qū)組織備用。將其中6 只大鼠的組織分別提取總蛋白后,取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳,電泳分離完成后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉后,4℃孵育NeuN 抗體、SYP 抗體、p-Nrf2 抗體、HO-1 抗體及內(nèi)參GAPDH 抗體過(guò)夜。次日,將條帶洗滌后孵育相應(yīng)二抗1 h。孵育完成后,將條帶進(jìn)行清洗并用ECL 顯影成像。曝光圖像用NIH Image J 對(duì)灰度值進(jìn)行分析,GAPDH 抗體所對(duì)應(yīng)條帶的灰度值作為內(nèi)參進(jìn)行校正。統(tǒng)計(jì)時(shí)將假手術(shù)組的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為1,計(jì)算各組的相對(duì)灰度值。

        2.7 腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

        將剩余的6 只大鼠海馬CA1 區(qū)組織稱重后置于9 倍質(zhì)量的生理鹽水中,冰浴制備勻漿。離心后取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)GSH-Px、SOD 的活性以及MDA 的含量進(jìn)行測(cè)定。

        2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析;多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 黃芩苷改善CCH 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷

        大鼠定位航行訓(xùn)練結(jié)果如表1和圖1所示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠在第2~5日的逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01);給予中、高劑量黃芩苷處理后,缺血大鼠逃逸潛伏期的延長(zhǎng)得到了逆轉(zhuǎn)(P<0.05 或P<0.01)。在探索實(shí)驗(yàn)中,與假手術(shù)組大鼠比較,模型組大鼠在目標(biāo)象限所待時(shí)間明顯縮短(P<0.01),給予中、高劑量黃芩苷能顯著延長(zhǎng)缺血大鼠在目標(biāo)象限所待時(shí)間(P<0.01)。

        表1 黃芩苷改善CCH 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷(n=12)Tab 1 Baicalin ameliorated the spatial learning and memory impairment induced by CCH in rats (n=12)

        圖1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)典型游泳軌跡圖Fig 1 Typical swimming paths of different groups in the Morris water maze task

        3.2 黃芩苷改善CCH 大鼠非空間學(xué)習(xí)記憶損傷

        圖2A 為新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖2B 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠的分辨指數(shù)明顯降低(P<0.01)。給予中、高劑量黃芩苷治療能顯著改善腦缺血所引起的分辨指數(shù)降低(均P<0.01)。

        圖2 黃芩苷對(duì)CCH 大鼠非空間學(xué)習(xí)記憶損傷的影響(n=12)Fig 2 Effect of baicalin on the non-spatial learning and memory impairment induced by CCH in rats(n=12)

        3.3 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)LTP 的抑制

        圖3A 為大鼠海馬Schaffer 側(cè)枝-CA1 區(qū)LTP誘導(dǎo)前后EPSPs 圖。圖3B 顯示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠的LTP 的誘導(dǎo)明顯受到抑制(P<0.01)。給予中、高劑量黃芩苷后能部分逆轉(zhuǎn)缺血大鼠LTP 誘導(dǎo)的抑制(P<0.05)。

        圖3 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)LTP 的抑制(n=12)Fig 3 Baicalin ameliorated the CCH-induced inhibition on LTP at the CA1 area of the hippocampus in rats(n=12)

        3.4 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元及突觸損傷

        為進(jìn)一步探討黃芩苷改善慢性腦缺血的分子生物學(xué)途徑,我們選擇黃芩苷中劑量給藥組進(jìn)行后續(xù)機(jī)制分析。如圖4A 及4B 所示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠NeuN 及SYP 的表達(dá)顯著降低(P均<0.01)。給予100 mg·kg-1黃芩苷后能顯著上調(diào)缺血大鼠NeuN 及SYP 的表達(dá)(P均<0.05)。

        圖4 黃芩苷對(duì)CCH 大鼠海馬CA1區(qū)NeuN 及SYP 表達(dá)的影響(n=6)Fig 4 Effect of baicalin on the expression of NeuN and SYP induced by CCH in hippocampal CA1 area of rats(n=6)

        3.5 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)的氧化應(yīng)激指標(biāo)

        如表2所示,與假手術(shù)組大鼠比較,缺血大鼠海馬CA1 區(qū)GSH-Px 及SOD 的活性顯著降低(均P<0.01),MDA 的含量顯著升高(P<0.01);給予100 mg·kg-1黃芩苷后能顯著上調(diào)GSH-Px 和SOD 的活性以及降低MDA 的含量(P均<0.05)。

        表2 黃芩苷對(duì)CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(n=6)Tab 2 Effect of baicalin on the oxidative stress induced by CCH in hippocampal CA1 area of rats (n=6)

        3.6 黃芩苷促進(jìn)CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的激活

        如圖5所示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠海馬CA1 區(qū)p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。給予100 mg·kg-1黃芩苷后能進(jìn)一步促進(jìn)缺血大鼠p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.01)。

        圖5 黃芩苷對(duì)CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的影響(n=6)Fig 5 Effect of baicalin on the activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway in the hippocampal CA1 of rats after CCH(n=6)

        4 討論

        VaD 是一種年齡相關(guān)性的癡呆類型。近年來(lái),隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇,VaD 越來(lái)越受到人們的關(guān)注,但關(guān)于VaD 的發(fā)病機(jī)制目前還未研究清楚,其治療也尚無(wú)批準(zhǔn)的有效藥物。因此深入VaD 的研究迫在眉睫。通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)建立大鼠CCH 模型是研究VaD 最常用的一種模型[2]。借助此模型,本研究發(fā)現(xiàn)CCH 能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)顯著的空間及非空間學(xué)習(xí)記憶損傷,給予中、高劑量黃芩苷(100、200 mg·kg-1)可顯著改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷。

        LTP 可以從突觸可塑性的角度闡明學(xué)習(xí)記憶形成的細(xì)胞分子機(jī)制[7];而神經(jīng)元和突觸變化可以從結(jié)構(gòu)可塑性的機(jī)制闡明學(xué)習(xí)記憶的改變[8]。本研究通過(guò)在體場(chǎng)電位記錄大鼠海馬CA1 區(qū)LTP,進(jìn)一步證實(shí)中、高劑量黃芩苷可以改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷。并且,黃芩苷改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷可能與抑制海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元及突觸損傷有關(guān)。

        事實(shí)上,大量研究顯示黃芩苷可以改善腦缺血損傷[9-10],并且對(duì)多種模型引起的認(rèn)知障礙有改善作用[11-12]。黃芩苷改善缺血損傷的一個(gè)重要機(jī)制是緩解缺血引起的氧化應(yīng)激[5,10]。氧化應(yīng)激是由于組織氧化還原的平衡狀態(tài)被破壞,從而引起自由基大量聚集、膜脂質(zhì)破壞、DNA 裂解、蛋白氧化;最終可導(dǎo)致突觸丟失,神經(jīng)元死亡,突觸可塑性減弱。抑制氧化應(yīng)激損傷已被充分證實(shí)可以減少神經(jīng)元的丟失和突觸的破壞,改善認(rèn)知功能[13-14]。GSH-Px活性、SOD 活性降低及MDA 含量通常聯(lián)系起來(lái)作為評(píng)估氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)。GSH-Px 和SOD 是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶;而MDA 含量可以間接反映出細(xì)胞受自由基損害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)給予黃芩苷后能顯著逆轉(zhuǎn)CCH 引起的GSH-Px 和SOD 活性降低及MDA 含量升高。提示黃芩苷改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷是通過(guò)抗氧化實(shí)現(xiàn)的。

        Nrf2 作為核轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞防御多種應(yīng)激損傷中起重要作用。氧化應(yīng)激時(shí),Nrf2 可發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,在細(xì)胞核內(nèi)積聚并進(jìn)一步識(shí)別、結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件,從而啟動(dòng)具有細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的多種抗氧化酶基因(如HO-1)的轉(zhuǎn)錄,達(dá)到降低氧化應(yīng)激水平,保護(hù)細(xì)胞和組織的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)CCH 模型大鼠海馬CA1區(qū)p-Nrf2 及HO-1 的蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),提示Nrf2/HO-1 通路激活,這可能是機(jī)體啟動(dòng)的一種自我保護(hù)機(jī)制,與此前報(bào)道相一致[17]。給予黃芩苷后,p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),證實(shí)黃芩苷可能是通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1 通路的激活,緩解氧化應(yīng)激損傷,從而改善CCH 所致的認(rèn)知障礙。這與文獻(xiàn)報(bào)道在其他模型下黃芩苷可經(jīng)Nrf2/HO-1 通路調(diào)控氧化應(yīng)激損傷相一致[18]。

        綜上所述,本研究通過(guò)大鼠CCH 模型,發(fā)現(xiàn)黃芩苷能改善CCH 所致的認(rèn)知障礙,其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的激活,抑制CCH 所引起的氧化應(yīng)激,緩解神經(jīng)元及突觸損傷有關(guān)。

        猜你喜歡
        黃芩海馬批號(hào)
        一種JTIDS 信號(hào)批號(hào)的離線合批方法
        海馬
        黃芩的高產(chǎn)栽培技術(shù)
        張永新:種植黃芩迷上了“茶”
        黃芩使用有講究
        海馬
        醫(yī)學(xué)科技期刊中藥品生產(chǎn)批號(hào)標(biāo)注探析
        中藥材批號(hào)劃分與質(zhì)量管理
        中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:26
        黃芩苷脈沖片的制備
        中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:54
        “海馬”自述
        性动态图av无码专区| 亚洲av熟女一区二区三区站| 日韩欧美亚洲国产精品字幕久久久 | 亚洲毛片αv无线播放一区| 伊人婷婷在线| 久久av一区二区三区下| 精品色老头老太国产精品| 日本av一区二区三区视频| 国产免费av片无码永久免费 | 四虎在线中文字幕一区| 国产禁区一区二区三区| 无码人妻精品一区二区在线视频| 台湾佬娱乐中文22vvvv| www.91久久| 免费观看日本一区二区三区| 久久精品日本不卡91| 把女邻居弄到潮喷的性经历| 伊人精品在线观看| 黑丝国产精品一区二区| 日本亚洲精品一区二区三| 免费观看激色视频网站| 色爱无码A V 综合区| 精品亚洲国产亚洲国产| 国产午夜免费高清久久影院| 久久婷婷香蕉热狠狠综合 | 加勒比久草免费在线观看| 天天干天天日夜夜操| 久久久久久久久久久国产| 无码区a∨视频体验区30秒| 手机免费高清在线观看av| 少妇激情一区二区三区视频| 国产成人精品午夜福利在线| 中文天堂一区二区三区| 欧美熟妇另类久久久久久多毛| 国产成人综合色在线观看网站| 亚洲区小说区图片区| 黄色三级一区二区三区| 成年av动漫网站18禁| 国产精品成人一区二区三区| 无码流畅无码福利午夜| 亚洲一区二区日韩专区|