孫欽勇，馮中，張朝，杜麗平，張貴民（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東臨沂 273400）

他達(dá)拉非（tadalafil）為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）特異性磷酸二酯酶5 的選擇性抑制劑[1]，分子式為C22H19N3O4，分子量為389.41，是繼西地那非和伐地那非的第三代臨床通過抑制5 型磷酸二酯酶（PDE5）治療勃起功能障礙（ED）的藥物[2]，具有療效好、作用持久、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。

他達(dá)拉非片原研廠家為美國Lilly Company，商品名為CIALIS，于2003年在FDA 批準(zhǔn)，上市規(guī)格為2.5 mg，5 mg，10 mg 和20 mg。他達(dá)拉非屬于生物藥劑學(xué)（BCS）Ⅱ類[3]，即低溶解性-高滲透，在水中溶解度低影響了藥物的溶出速度，導(dǎo)致其生物利用度低且吸收差異度大[4]，目前國內(nèi)有關(guān)他達(dá)拉非片制劑工藝的研究文獻(xiàn)較少。本研究以CIALIS 為參比制劑，通過對原研片的處方及制備工藝進(jìn)行調(diào)研，對其溶出曲線、溶出率、硬度、崩解時限等指標(biāo)進(jìn)行測定，旨在尋找能使自制片與參比制劑性質(zhì)接近的制備工藝。預(yù)試驗(yàn)表明，選用濕法制粒工藝制備內(nèi)顆粒與外加輔料混合后壓片，得到自制片與原研片溶出率和溶出相似因子略有差異，其他性質(zhì)基本接近。本試驗(yàn)擬采用Box-Behnken 法優(yōu)化配方工藝，期望提高自制片與原研片的溶出率與溶出相似因子，同時用Beagle 犬對自制片與原研片在體內(nèi)的藥代動力學(xué)進(jìn)行評價(jià)。

1 材料

CPR-18 型 8沖旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)（意大 利BONAPACE）；TMG 1/6 型混合制粒機(jī)（德國Glatt）；Quadro? Comil? U5 型錐式整粒機(jī)（IDEX Corperation，USA）；Mini/Midi-Glatt 型流化床/GC1 型包衣機(jī)（德國Glatt）；DT50 型自動崩解儀（瑞士Sotax）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo）；System 860DL 型溶出儀（美國Logan）；HDT-400C 硬度儀（美國Logan）；TSQ Quantum UltraAM 型LC-MS/MS 聯(lián)用儀（美國 Thermo Finnigan）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；Spiral Jet Mill MC44 型氣流粉碎機(jī)（昆山優(yōu)納克機(jī)械有限公司）。

他達(dá)拉非片（商品名CIALIS）（參比制劑，Lilly USA，規(guī)格：20 mg，批號：C931765A）；他達(dá)拉非原料藥（山東新時代藥業(yè)有限公司，含量：99.9%，批號：20191001）；（6S，12aS）-tadalafil 對照品（含量：99.8%，批號：16121401）、地西泮對照品（含量：99.9%，批號：181116-201903）（上海特化醫(yī)藥科技公司）；一水乳糖（DFE，批號：104BX94）；羥丙基纖維素（Nippon soda，批號：NID-0831）；十二烷基硫酸鈉（BASF，批號：5190200001966）；微晶纖維素（MingTai，批號：5190800005267）；羧甲基纖維素鈉（JRS，批號：32010183144）；硬脂酸鎂（Peter Greven，批號：518022299）；歐巴代（卡樂康，批號：H20170700）；正己烷、異丙醇、甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

Beagle 犬，雄性，體質(zhì)量（6.5±0.5）kg [北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SYXK（魯）20180007]。動物飼養(yǎng)于山東新時代藥業(yè)藥理中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±4）℃，濕度35%～75%，12 h/12 h 交替照明。動物給藥前禁食過夜（12 h），可自由飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)室動物飼養(yǎng)和使用指導(dǎo)原則，取血在山東新時代藥業(yè)藥理中心完成。

2 方法與結(jié)果

2.1 他達(dá)拉非片的制備

稱取一水乳糖245.00 g、羥丙基纖維素8.23 g、十二烷基硫酸鈉1.00 g 分別過40 目篩后與他達(dá)拉非原料藥20.00 g [粒徑為5 μm（D90）]，充分混勻，濕法制備內(nèi)顆粒，流化床干燥，所得顆粒與微晶纖維素52.50 g、羧甲基纖維素鈉22.40 g 混合均勻，加入過80 目篩的硬脂酸鎂0.87 g，混合5 min，壓片，目標(biāo)片重350 mg，目標(biāo)硬度90～110 N，10%歐巴代溶液包衣增重3%即得。

2.2 他達(dá)拉非含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱?。?S，12aS）-tadalafil 對照品適量，加正己烷∶異丙醇∶乙腈＝40∶40∶20（V/V/V）溶解，稀釋制成0.25 mg·mL－1的溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取他達(dá)拉非參比制劑兩片，用研缽研碎后精密稱取粉末約45 mg，加正己烷∶異丙醇∶乙腈＝40∶40∶20（V/V/V）溶解，稀釋制成0.25 mg·mL－1的溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱HiChrom Partisil SCX（250 mm×4.60 mm，5 μm），流動相為正己烷∶異丙醇＝50∶50（V/V）；檢測波長285 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL[5-6]。

本色譜條件下他達(dá)拉非質(zhì)量濃度（C）在0.025～0.500 mg·mL－1內(nèi)與峰面積（A）線性關(guān)系良好，回歸方程為A＝1.963×104C＋20.13，r＝0.9998。取供試品溶液（0.26 mg·mL－1）分別 在0、2、4、6、8、12、24、48 h 取樣，測得樣品的RSD為1.6%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。高、中、低濃度的平均加樣回收率（n＝3）分別為99.8%、99.5%和98.6%，RSD值分別為0.45%、0.62%和0.97%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.2.4 他達(dá)拉非溶出方法 采用 FDA 溶出度數(shù)據(jù)庫推薦的溶出測定裝置Ⅱ（槳法），選用0.5% SDS 溶液 1000 mL 作為溶出介質(zhì)，溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，分別于5、10、20、30、45 min 取樣測定含量[7]。

2.2.5 基礎(chǔ)處方的質(zhì)量評價(jià)結(jié)果 照“2.1”項(xiàng)下處方和工藝制備他達(dá)拉非自制片，并照上述方法進(jìn)行溶出率與溶出曲線相似因子的測定，自制片與參比制劑的f2為48.9；溶出率為參比制劑的（87.4±3.9）%，結(jié)果表明，該基礎(chǔ)處方工藝不能初步滿足他達(dá)拉非片溶出的要求，需進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 效應(yīng)面法優(yōu)化溶出率

經(jīng)處方分析，一水乳糖為填充劑，占比較大，對物料的流動性、混合均勻度、片劑成型、崩解時限以及溶出等都具有顯著影響，羥丙基纖維素是常用的崩解劑，其用量影響片劑的崩解，因一水乳糖與羥丙基纖維素的比例影響藥物的崩解與溶出，將其作為重點(diǎn)考察，確立為因素A；他達(dá)拉非為BCSⅡ類，原料藥粒徑會改變藥物的溶解性，因此將原料藥的粒徑（D90，μm）確立為因素B；十二烷基硫酸鈉分子結(jié)構(gòu)中含有烷基，能增加他達(dá)拉非的溶出，將其百分量占比作為因素C。在進(jìn)行溶出度檢測時，20 min 時自制片與參比制劑溶出率差異最大，作為相似因子的評價(jià)指標(biāo)；45 min 時參比制劑溶出率達(dá)97%，選擇45 min 考察最終溶出率；定義相似因子與溶出率的綜合評價(jià)指標(biāo)為Y，Y＝Y(jié)20＋1.25Y45（Y20、Y45為自制片與參比制劑20 min、45 min 溶出率差的絕對值，Y20約為Y45的1.25 倍，進(jìn)行1.25 倍的加權(quán)修正）。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表和試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2，運(yùn)用Design-Expert 8.06 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合和分析。按“2.1”項(xiàng)下工藝制備片劑，按“2.2.4”項(xiàng)下方法檢測溶出。

表1 BBD 設(shè)計(jì)因素水平表Tab 1 Factors and levels for BBD design

表2 各因素對片劑溶出率的影響Tab 2 Effect of various factors on dissolution

使用Design-Expert 8.0.6 對溶出率試驗(yàn)結(jié)果（Y）進(jìn)行多元回歸分析，所得回歸方程擬合Y＝90.07－3.90A＋1.53B－107.16C－0.11AC－0.23BC＋0.066A2＋0.21B2＋206.55C2，R2＝0.9895，二項(xiàng)式模型擬合的P值為0.0001（P＜0.05），表明精密度良好，模型能較好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，能應(yīng)用于自制片的處方篩選試驗(yàn)。

根據(jù)上述方程繪制自變量A、B、C對評價(jià)指標(biāo)Y的等高線和效應(yīng)面，見圖1，由圖可知，因素A、B、C相互之間均具有較為明顯的交互作用，根據(jù)設(shè)計(jì)的評價(jià)指標(biāo)應(yīng)選擇區(qū)域最低點(diǎn)為目標(biāo)值，此效應(yīng)面有較優(yōu)區(qū)域，其中對Y影響最大的為一水乳糖與羥丙基纖維素的比例，其次為原料藥的粒徑分布。片劑崩解行為根據(jù)Design-Expert 8.06 軟件推薦的處方并結(jié)合片劑制備的實(shí)際情況，確定單片處方中一水乳糖∶羥丙基纖維素為30∶1，原料藥粒徑為4.5 μm，十二烷基硫酸鈉用量為0.26%。

圖1 Y 的三維響應(yīng)面圖Fig 1 Three-dimensional response surface plots of Y

2.4 處方驗(yàn)證

采用優(yōu)化后的處方，稱取一水乳糖735.5 g、羥丙基纖維素24.51 g、十二烷基硫酸鈉2.730 g分別過40 目篩后與他達(dá)拉非原料藥60.00 g（粒徑為4.5 μm）充分混勻制備內(nèi)顆粒，加入微晶纖維素157.5 g，羧甲基纖維素鈉67.20 g，混合均勻后加入過80 目篩的硬脂酸鎂2.630 g，混合均勻后壓片，控制片重為350 mg 壓片，10%歐巴代溶液包衣增重至片重的3%即得。自制批量為3000 片的3 批他達(dá)拉非片，所得制品為暗黃色、光滑杏仁狀藥片，他達(dá)拉非片的基本參數(shù)見表3。

表3 他達(dá)拉非自制片物理性質(zhì)及其含量Tab 3 Physical properties and content of self-made tadalafil tablets

按照“2.2.4”項(xiàng)下溶出方法測定3 批自制片和參比制劑（C931765A）在0.5% SDS 溶液的溶出曲線（n＝6）見圖2，最終溶出率差異見表4，溶出度相似因子f2見表5，可認(rèn)為自制片與參比制劑在4 種溶出介質(zhì)中體外溶出行為相似。

圖2 不同介質(zhì)中體外溶出曲線對比Fig 2 Dissolution profiles in different media

表4 參比制劑與3 批自制片在不同介質(zhì)中的溶出率(%)Tab 4 Dissolution curve of 3 batches of self-made tablets and reference listed drug in different media (%)

表5 3 批自制片和參比制劑在不同介質(zhì)中溶出曲線相似性f2Tab 5 f2 of 3 batches of self-made tablets and reference listed drug in different media

2.5 體內(nèi)藥代動力學(xué)

2.5.1 色譜條件 色譜柱Welch Ultimate XB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶10 mmol·L－1乙酸銨（含0.1%甲酸）＝95∶5；流速：0.3 mL·min－1；柱溫：40 ℃；樣品盤溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；離子檢測方式：MRM；離子極性：正離子；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；錐孔氣：65 L·h－1；脫溶劑氣：680 L·h－1；正離子方式檢測，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM），用于定量的離子分別為他達(dá)拉非[M＋H]＋m/z：母離子390.4，子離子268.2，碰撞電壓CV 40 V，碰撞能CE 22 V；內(nèi)標(biāo)地西泮[M＋H]＋m/z：母離子285.3，子離子 154.2，碰撞電壓40 V，碰撞能CE 30 V。

2.5.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精確稱量10.03 mg 的地西泮對照品置10 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解、稀釋定容至刻度線，制備成1000 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)地西泮儲備液，取適量儲備液用甲醇稀釋至200 ng·mL－1即得。

2.5.4 血漿樣品的處理 精密移取血漿200 μL，加入20 μL 地西泮對照品溶液（200 ng·mL－1）置20 mL EP 管中，渦旋混勻30 s，加入3 mL 提取劑（乙醚∶二氯甲烷＝70∶30），渦旋混勻3 min，3000 r·min－1離心10 min，取有機(jī)層2.4 mL，40℃、N2吹干，用200 μL 流動相復(fù)溶，4℃、10 000 r·min－1離心10 min，取150 μL 于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量10 μL。

2.5.5 方法學(xué)考察 他達(dá)拉非質(zhì)量濃度（C）在1.0～2000 ng·mL－1內(nèi)與峰面積（Y）線性關(guān)系良好，回歸方程Y＝0.007 82C＋0.001 99，R2＝0.9969；建立比格犬血漿濃度的含量測定方法，結(jié)果表明，在蒸餾水和血漿中分別加入內(nèi)標(biāo)和他達(dá)拉非10、100、1000 ng·mL－1，測得的基質(zhì)效應(yīng)在83.51%～90.32%，說明血漿對他達(dá)拉非的測定無干擾；日內(nèi)和日間精密度分別在3.4%～8.1%和2.8%～8.9%，日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度在1.4%～4.1%和0.3%～4.5%；他達(dá)拉非回收率在86.71%～97.51%，內(nèi)標(biāo)回收率91.28%；樣品在－20℃放置7 d，反復(fù)凍融3 次期間測得的樣品的含量在98.31～103.54%，表明本法可準(zhǔn)確測定Beagle 犬血漿中他達(dá)拉非的含量。

2.5.6 藥動學(xué)方案及樣品處理 采用單劑量雙周期交叉試驗(yàn)方案[7-8]，14 只雄性Beagle 犬，隨機(jī)分成兩組（A 組和B 組），洗凈期為一周。對Beagle 犬稱重，試驗(yàn)前禁食12 h，空腹分別給予A、B 組他達(dá)拉非自制片和參比制劑20 mg，給藥前與給藥后0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、8.0、16.0、24.0、36.0、48.0 h 于前肢或后肢靜脈取血約4 mL，置于肝素鈉采血管中，3500 r·min－1離心10 min，取上清樣品置于2 mL 離心管中，置于－20℃冰箱中冷凍保存。

2.5.7 藥動學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 按照“2.5.4”項(xiàng)下方法處理血液樣本，通過色譜分析并計(jì)算，繪制平均血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖3。采用DAS 2.0軟件，利用非房室模型進(jìn)行擬合[9-10]，主要藥動學(xué)參數(shù)見表6。

圖3 他達(dá)拉非自制片和參比制劑CIAIS 的平均藥-時曲線Fig 3 Average plasma concentration-time curve of tadalafil tablets and CIAIS

表6 Beagle 犬口服自制片和CIAIS 片后的主要藥動學(xué)參數(shù)(±s，n＝14)Tab 6 Main pharmacokinetic parameters of self-made and CIAIS of Beagle dogs after an oral administration (±s，n＝14)

表6 Beagle 犬口服自制片和CIAIS 片后的主要藥動學(xué)參數(shù)(±s，n＝14)Tab 6 Main pharmacokinetic parameters of self-made and CIAIS of Beagle dogs after an oral administration (±s，n＝14)

Vz/F/（L·kg－1）自制片 750.80±106.23 773.24±109.22 1.86±0.23 100.24±10.20 9.48±1.70 0.026±0.004 0.38±0.08 CIAIS 片（參比制劑） 783.51±100.29 823.34±115.35 1.71±0.26 102.36±7.32 11.33±1.50 0.025±0.003 0.40±0.05制劑 AUC0～t /（ng·h·mL－1）（ng·h·mL－1） tmax/h Cmax/AUC0～∞/（ng·mL－1） t1/2/h CLz/F/（L·h·kg－1）

由表6可知，自制片Cmax、tmax與參比制劑CIAIS 基本一致。參比制劑和自制片的AUC0～t、AUC0～∞、Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，兩種制劑上述的參數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)雙側(cè)t檢驗(yàn)及（1－2α）%置信區(qū)間（CI）法計(jì)算得自制片AUC0～t、AUC0～∞、Cmax的 90%CI分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的87.8%～104.2%、86.3%～102.2%、91.6%～104.2%，均在80%～125%，說明兩者的AUC0～t、AUC0～∞、Cmax等效。采用 Wilcoxon 檢驗(yàn)比較兩種制劑的tmax，結(jié)果顯示兩者tmax無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

一水乳糖作為填充劑和黏合劑能增加藥片的耐磨性，加快崩解；羥丙基纖維素為賦形劑、崩解劑，增加藥片的成形性，通過響應(yīng)面法優(yōu)化兩者配比；他達(dá)拉非水溶性較差，氣流粉碎后能增加藥物的相對比表面積，增加藥物的溶解性，提高藥物的溶出速率；十二烷基硫酸鈉是一種表面活性劑，能減少壓片過程中出現(xiàn)的黏沖、脫片等現(xiàn)象，能顯著改善難溶性藥物的溶出[11]，因此采用BBD 設(shè)計(jì)法對這3 種因素進(jìn)行考察。BBD 設(shè)計(jì)是目前最常用的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案的方法之一，在各個學(xué)科領(lǐng)域均發(fā)揮著重要作用[12]，通過對一水乳糖與羥丙基纖維素的比例，原料藥粒徑以及十二烷基硫酸鈉的用量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定處方中一水乳糖∶羥丙基纖維素為30∶1，原料藥粒徑4.5 μm，十二烷基硫酸鈉用量為0.26%時與參比制劑有較好的相似性。

隨著藥物粒徑的減小，比表面積增大，孔隙率增加，吸附性增強(qiáng)，溶解性增強(qiáng)[13]，生物利用度增高，但他達(dá)拉非原料隨著粒徑的增大，溶出率和相似因子先增大后減小，主要原因可能為藥物粒徑減小到一定程度，藥物表面光滑[14]，不易被潤濕。隨著十二烷基硫酸鈉比例的增高，藥物溶出率增高（Y45），20 min 時自制片與參比制劑溶出的絕對值在增大，不利于他達(dá)拉非與參比制劑溶出相似因子的改善，此可能為Y值隨十二烷基硫酸鈉用量增加先增大后減小的主要原因。

通常體外相關(guān)性較高，則體外釋放條件越能模擬人體內(nèi)的環(huán)境[15]，自制他達(dá)拉非片體外溶出曲線與參比制劑相似性較好，Beagle 犬體內(nèi)藥時曲線與參比制劑相關(guān)性都較高，所以此處方可進(jìn)行進(jìn)一步用于人體等效性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的藥動學(xué)方法，可為他達(dá)拉非在臨床上生物等效實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。