HPLC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩袅康姆椒ㄑ芯?/h1>
2021-09-01 13:31:50李康柏許均圖陳德斌洪瑞申
現(xiàn)代食品 2021年12期
◎ 陳 燕，李康柏，許均圖，陳德斌，洪瑞申，王 景
（廣州華鑫檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510642）
呋喃唑酮是硝基呋喃類(lèi)的一種，有良好的抑菌作用，可用于治療因細(xì)菌和原蟲(chóng)引發(fā)的腸道疾?。ㄈ缒c炎，痢疾，潰瘍等）。呋喃唑酮經(jīng)代謝后會(huì)產(chǎn)生呋喃唑酮代謝物，與呋喃唑酮一起經(jīng)食物鏈積累到人體內(nèi)，過(guò)量可導(dǎo)致頭暈、惡習(xí)和腹瀉等不良癥狀[1]。我國(guó)早在2008年就將包含呋喃唑酮在內(nèi)的硝基呋喃類(lèi)藥物列為禁用藥，不得在動(dòng)物性食品中檢出[2]。
針對(duì)呋喃唑酮這一禁用藥物，我國(guó)制定了一系列行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象主要包括飼料[3]、水產(chǎn)品[4]、動(dòng)物性食品[5]，大都基于高效液相色譜法，但對(duì)于部分初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品及其加工食品不夠靈敏高效，所以開(kāi)發(fā)靈敏可靠的檢測(cè)方法極為重要。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫1200-6410）；漩渦振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA RV 10 Basic V）；純水機(jī)（Millipore Milli-Q）；分析天平（賽多利斯BSA224S-CW）；分液漏斗；抽濾裝置。
二氯甲烷和甲醇為色譜純級(jí)別，購(gòu)于漢尼韋爾公司；乙酸銨和無(wú)水硫酸鈉為分析純級(jí)別，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。
1.2 呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自西格瑪公司，準(zhǔn)確稱取10 mg呋喃唑酮，用50 mL甲醇超聲溶解，并用甲醇定容至100 mL，配成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，放置于-18 ℃的冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取儲(chǔ)備液放至室溫，根據(jù)需要配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.3 儀器工作參數(shù)
（1）液相色譜條件。安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜分離柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.005 mol·L-1醋酸銨；流動(dòng)相B：乙腈，A∶B=8∶2；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積，10.0 μL。
（2）電噴霧離子源參數(shù)設(shè)置：正模式；溫度350 ℃；氣流速10 L·min-1；壓力345 kPa；電壓4 000 V；MRM多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)。母離子和子離子質(zhì)荷比參數(shù)設(shè)置如表1所示。
表1 呋喃唑酮的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置表
1.4 測(cè)定步驟
（1）提取。稱取5.00 g（精確至0.01 g）樣品，置于50 mL離心管中，避光，加入15 mL二氯甲烷，振搖5 min，靜置分層，取下層二氯甲烷于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL二氯甲烷重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷，將所收集到的二氯甲烷提取液經(jīng)無(wú)水NaSO4柱濾入梨形瓶中，再用10 mL二氯甲烷沖洗無(wú)水NaSO4柱，并用洗耳球吹出柱中液體，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃減壓蒸發(fā)溶劑至干。
（2）凈化。加入1 mL流動(dòng)相至濃縮瓶，用漩渦振蕩器振蕩潤(rùn)洗2 min，經(jīng)0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。
（3）空白實(shí)驗(yàn)。除不加試樣外，與試樣實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行。
1.5 結(jié)果計(jì)算
試樣中呋喃唑酮的含量X按式（1）進(jìn)行計(jì)算。
式（1）中，X-試樣中呋喃唑酮的實(shí)際計(jì)算含量，μg·kg-1；CS-標(biāo)準(zhǔn)溶液中呋喃唑酮的理論濃度，ng·mL-1；A1-試樣液中呋喃唑酮的實(shí)際測(cè)試峰面積；A2-空白試驗(yàn)的實(shí)際測(cè)試峰面積；V-試樣的定容體積，mL；AS-標(biāo)準(zhǔn)中呋喃唑酮的實(shí)際測(cè)試峰面積。
2 結(jié)果與分析
2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化
取1.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液至樣品瓶中，在不經(jīng)過(guò)色譜柱分離的情況下，分別于正、負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)試，確定呋喃唑酮的母離子為226.2，監(jiān)測(cè)模式為正離子模式。通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分析，確定在質(zhì)荷比122.3處豐度最強(qiáng)，故選取作為定量離子，139.3作為定性離子。
2.2 提取試劑的優(yōu)化
分別采用不同的提取試劑做單因子變量實(shí)驗(yàn)，在添加水平0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1三個(gè)濃度處分別做6組平行測(cè)試。用乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、環(huán)己烷作為提取試劑時(shí)，具體的回收率如表2所示。
表2 不同提取劑的呋喃唑酮回收率統(tǒng)計(jì)表
從表2分析可得，乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷作提取試劑時(shí)回收率較差，選用二氯甲烷作為提取劑時(shí)回收率較好，故選取二氯甲烷作為提取試劑。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
配制濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次通過(guò)C18反相色譜柱分離、電噴霧離子化后進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜分析，以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度的儀器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)現(xiàn)呋喃唑酮在0.5～20 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，變異系數(shù)為0.998 7，擬合方程為y=769.68x-111.1，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1 呋喃唑酮的擬合曲線和方程圖
通過(guò)C18色譜柱分離，確定呋喃唑酮的保留時(shí)為3.2 min，子離子122.3和139.3響應(yīng)靈敏，結(jié)果如圖2、圖3所示。
圖2 呋喃唑酮總離子流圖
圖3 呋喃唑酮多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖
2.4 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)
（1）靈敏度。應(yīng)用本方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮，取3倍最低檢測(cè)信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)量為方法檢出限，10倍為定量限，算得檢測(cè)限為0.3 μg·kg-1，定量限1.0 μg·kg-1。
（2）準(zhǔn)確度。本方法檢測(cè)食品中呋喃唑酮在0.5～20.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。 在0.10～1.00 μg·kg-1添加水平下，呋喃唑酮的回收率為74.6%～93.0%。
（3）精密度。應(yīng)用本方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮,取羅非魚(yú)雞肉為樣品，做6個(gè)平行加標(biāo)樣，加標(biāo)含量為1.0 μg·kg-1，測(cè)得樣品濃度如表3所示，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD6為3.85。
表3 精密度計(jì)算表
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS測(cè)定動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法，采用二氯甲烷作為提取劑，樣品提取液經(jīng)凈化、濃縮后，由C18反相色譜柱分離，MRM模式定量檢測(cè)。該方法具有效率高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適用于動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)。
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針對(duì)呋喃唑酮這一禁用藥物，我國(guó)制定了一系列行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象主要包括飼料[3]、水產(chǎn)品[4]、動(dòng)物性食品[5]，大都基于高效液相色譜法，但對(duì)于部分初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品及其加工食品不夠靈敏高效，所以開(kāi)發(fā)靈敏可靠的檢測(cè)方法極為重要。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫1200-6410）；漩渦振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA RV 10 Basic V）；純水機(jī)（Millipore Milli-Q）；分析天平（賽多利斯BSA224S-CW）；分液漏斗；抽濾裝置。
二氯甲烷和甲醇為色譜純級(jí)別，購(gòu)于漢尼韋爾公司；乙酸銨和無(wú)水硫酸鈉為分析純級(jí)別，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。
1.2 呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自西格瑪公司，準(zhǔn)確稱取10 mg呋喃唑酮，用50 mL甲醇超聲溶解，并用甲醇定容至100 mL，配成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，放置于-18 ℃的冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取儲(chǔ)備液放至室溫，根據(jù)需要配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.3 儀器工作參數(shù)
（1）液相色譜條件。安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜分離柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.005 mol·L-1醋酸銨；流動(dòng)相B：乙腈，A∶B=8∶2；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積，10.0 μL。
（2）電噴霧離子源參數(shù)設(shè)置：正模式；溫度350 ℃；氣流速10 L·min-1；壓力345 kPa；電壓4 000 V；MRM多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)。母離子和子離子質(zhì)荷比參數(shù)設(shè)置如表1所示。
表1 呋喃唑酮的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置表
1.4 測(cè)定步驟
（1）提取。稱取5.00 g（精確至0.01 g）樣品，置于50 mL離心管中，避光，加入15 mL二氯甲烷，振搖5 min，靜置分層，取下層二氯甲烷于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL二氯甲烷重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷，將所收集到的二氯甲烷提取液經(jīng)無(wú)水NaSO4柱濾入梨形瓶中，再用10 mL二氯甲烷沖洗無(wú)水NaSO4柱，并用洗耳球吹出柱中液體，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃減壓蒸發(fā)溶劑至干。
（2）凈化。加入1 mL流動(dòng)相至濃縮瓶，用漩渦振蕩器振蕩潤(rùn)洗2 min，經(jīng)0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。
（3）空白實(shí)驗(yàn)。除不加試樣外，與試樣實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行。
1.5 結(jié)果計(jì)算
試樣中呋喃唑酮的含量X按式（1）進(jìn)行計(jì)算。
式（1）中，X-試樣中呋喃唑酮的實(shí)際計(jì)算含量，μg·kg-1；CS-標(biāo)準(zhǔn)溶液中呋喃唑酮的理論濃度，ng·mL-1；A1-試樣液中呋喃唑酮的實(shí)際測(cè)試峰面積；A2-空白試驗(yàn)的實(shí)際測(cè)試峰面積；V-試樣的定容體積，mL；AS-標(biāo)準(zhǔn)中呋喃唑酮的實(shí)際測(cè)試峰面積。
2 結(jié)果與分析
2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化
取1.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液至樣品瓶中，在不經(jīng)過(guò)色譜柱分離的情況下，分別于正、負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)試，確定呋喃唑酮的母離子為226.2，監(jiān)測(cè)模式為正離子模式。通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分析，確定在質(zhì)荷比122.3處豐度最強(qiáng)，故選取作為定量離子，139.3作為定性離子。
2.2 提取試劑的優(yōu)化
分別采用不同的提取試劑做單因子變量實(shí)驗(yàn)，在添加水平0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1三個(gè)濃度處分別做6組平行測(cè)試。用乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、環(huán)己烷作為提取試劑時(shí)，具體的回收率如表2所示。
表2 不同提取劑的呋喃唑酮回收率統(tǒng)計(jì)表
從表2分析可得，乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷作提取試劑時(shí)回收率較差，選用二氯甲烷作為提取劑時(shí)回收率較好，故選取二氯甲烷作為提取試劑。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
配制濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次通過(guò)C18反相色譜柱分離、電噴霧離子化后進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜分析，以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度的儀器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)現(xiàn)呋喃唑酮在0.5～20 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，變異系數(shù)為0.998 7，擬合方程為y=769.68x-111.1，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1 呋喃唑酮的擬合曲線和方程圖
通過(guò)C18色譜柱分離，確定呋喃唑酮的保留時(shí)為3.2 min，子離子122.3和139.3響應(yīng)靈敏，結(jié)果如圖2、圖3所示。
圖2 呋喃唑酮總離子流圖
圖3 呋喃唑酮多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖
2.4 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)
（1）靈敏度。應(yīng)用本方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮，取3倍最低檢測(cè)信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)量為方法檢出限，10倍為定量限，算得檢測(cè)限為0.3 μg·kg-1，定量限1.0 μg·kg-1。
（2）準(zhǔn)確度。本方法檢測(cè)食品中呋喃唑酮在0.5～20.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。 在0.10～1.00 μg·kg-1添加水平下，呋喃唑酮的回收率為74.6%～93.0%。
（3）精密度。應(yīng)用本方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮,取羅非魚(yú)雞肉為樣品，做6個(gè)平行加標(biāo)樣，加標(biāo)含量為1.0 μg·kg-1，測(cè)得樣品濃度如表3所示，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD6為3.85。
表3 精密度計(jì)算表
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS測(cè)定動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法，采用二氯甲烷作為提取劑，樣品提取液經(jīng)凈化、濃縮后，由C18反相色譜柱分離，MRM模式定量檢測(cè)。該方法具有效率高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適用于動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)。
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