◎ 李赫婧，王立平，楊紅蓮，薛晨玉，王 丹

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京 100094）

沙門氏菌是食源性疾病重要的致病菌，我國每年由沙門氏菌引起的中毒事件屢居首位[1]。依據(jù)現(xiàn)有食品安全國家標準[2]，食品中沙門氏菌的鑒定和分型多采用常規(guī)生化鑒定的方法，檢測周期長，操作煩瑣，費力、耗時，無法滿足食品安全突發(fā)事件應(yīng)急檢驗的要求[3]。采用合適的鑒定和分型方法，對致病菌的快速溯源具有重要意義[4-5]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）是近幾年發(fā)展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的生物質(zhì)譜技術(shù)，該方法基于細菌全細胞蛋白質(zhì)組指紋圖譜分析，通過與標準物質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫或者自建數(shù)據(jù)庫進行比較，可以鑒定至屬、種，乃至亞種的水平，具有快速、準確、通量高、成本低等優(yōu)點，適用于微生物的高通量篩選[6-8]。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型使用血清玻片凝集作為早期沙門氏菌分型方法，該方法直觀可靠，是大多數(shù)實驗室使用的分型方法。但存在耗時長，對實驗人員操作經(jīng)驗有要求，血清質(zhì)量參差不齊而導(dǎo)致結(jié)果偏差等不足之處。多位點序列分型（MLST）是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，該方法通過對多個管家基因內(nèi)部片段進行序列測定，分析菌株的變異，配合使用EnteroBase數(shù)據(jù)庫提供的物種持家基因信息比對獲得沙門氏菌各菌株的MLST分型，從而為沙門氏菌分型提供更高的分辨力和更明確的分型方法[9-10]。

本文采用生化鑒定和MALDI-TOF-MS對雞肉中分離的沙門氏菌進行種屬鑒定，采用傳統(tǒng)血清學(xué)方法和MLST分子手段進行血清型分型，比較不同的技術(shù)手段具有的優(yōu)缺點，剖析其方法機制，為實驗室進行沙門氏菌鑒定以及權(quán)衡每種分型技術(shù)的利弊提供參考，使實驗室能更好地根據(jù)菌株特性、分型目的和實驗室擁有的條件選擇合適方法進行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

生雞肉樣品，購自北京市市場；BPW培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SC培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、SWARM瓊脂等，購自北京陸橋培養(yǎng)基公司；沙門顯色培養(yǎng)基，購自法國科瑪嘉公司；腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒，購自法國梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，購自丹麥SSI公司；PCR預(yù)混液和細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物，由北京生工生物技術(shù)有限公司合成；IVD BTS、IVD HCCA，購自德國布魯克公司；乙腈、乙醇、三氟乙酸、甲酸和無水乙醇，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Sigma 3K18離心機、電熱恒溫水浴、Bio-RAD MyCyclerTM PCR儀、Bio-RAD電 泳 儀、Bio-RAD Gel Doc XR凝膠成像分析系統(tǒng)、布魯克基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、Nanodrop分光光度計。

1.3 沙門氏菌初篩

參照GB 4789.4—2016[2]方法進行生雞肉中沙門氏菌的初篩。無菌操作稱取25 g樣品，置于盛有225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)1 min左右，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。各移取1 mL增菌液轉(zhuǎn)接種于10 mL TTB和10 mL SC內(nèi)，分別于42 ℃和36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取TTB及SC培養(yǎng)液各1環(huán)，分別接種于一個BS瓊脂平板、一個XLD瓊脂平板和一個沙門氏菌顯色平板，于36 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、24 h和24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落進行后續(xù)試驗。

1.4 生化鑒定

挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌使用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒進行生化鑒定，參照其說明書進行操作，將各反應(yīng)管結(jié)果記錄于報告單上。計算數(shù)據(jù)得到7位數(shù)字編碼，通過APILAB PLUS鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。

1.5 質(zhì)譜鑒定

使用MALDI-TOF-MS進行質(zhì)譜鑒定，挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌涂抹在樣品靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫干燥，再滴加1 μL HCCA基質(zhì)溶液，室溫干燥，將靶板放入儀器內(nèi)，設(shè)定檢測參數(shù)，進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.6 MLST分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行沙門氏菌基因組提取，核酸質(zhì)量使用Nanodrop分光光度計進行測定。選取沙門氏菌7個管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA進行MLST分型，7個基因的擴增引物和測序引物參照SN/T 4525.1—2016合成[11]。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：PCR預(yù)混液（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）和下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模 板1 μL，超 純 水7 μL。PCR反 應(yīng) 條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min，最后4 ℃保存。

將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫進行MLST分型。

1.7 血清分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，以生理鹽水作為對照，參照GB 4789.4—2016[2]的方法進行O抗原和H抗原的血清分型。依次用O因子多價血清做凝集實驗，判定O群，再進行O復(fù)合因子血清或單因子血清的核對。確定O價抗原因子后，根據(jù)H抗原表所述H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化鑒定結(jié)果

經(jīng)過選擇性平板分離初篩，31個生雞肉樣品中共篩出15株可疑沙門氏菌，對其進行API生化鑒定，結(jié)果顯示其中11株為沙門氏菌屬，生化型分為6704552和6704752兩種，具體生化鑒定結(jié)果詳見表1。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對15株可疑沙門氏菌進行MALDI-TOF-MS鑒定，將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入儀器中自帶微生物指紋圖譜庫進行比對，比對運算后得到鑒定結(jié)果，查看鑒定分值，其中11株菌鑒定為沙門氏菌屬，具體質(zhì)譜鑒定結(jié)果詳見表1。

表1 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果表

2.3 MLST分型結(jié)果

將MLST測序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫（http：//mlst.war-wick.ac.uk/mlst）進行在線數(shù)據(jù)分析，11株菌共包含5個ST型，其中ST19型（5株）、ST34型（1株）和ST29型（1株）預(yù)測為鼠傷寒沙門菌，ST11型（3株）預(yù)測為腸炎沙門氏菌，ST1628型1株（EnteroBase數(shù)據(jù)庫中未對該ST型進行血清型預(yù)測）。MLST具體分型及預(yù)測血清型結(jié)果詳見表2。

表2 MLST和血清分型結(jié)果表

2.4 血清分型結(jié)果

使用丹麥SSI血清對11株沙門氏菌進行血清學(xué)分型實驗，共檢出3種血清型，分別為3株腸炎沙門氏菌、7株鼠傷寒沙門氏菌和1株里定沙門菌，具體血清學(xué)分型結(jié)果詳見表2。

2.5 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較與分析

本次對15株可疑沙門氏菌進行API生化鑒定和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示兩種方法對15株菌的鑒定結(jié)果均一致。生化鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定均能較準確的鑒定到沙門氏菌屬或種的水平，但是兩者的檢測用時和檢測成本不同。相比較傳統(tǒng)生化鑒定方法，質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點，一次實驗可以同時檢測96個樣品，可作為沙門氏菌高通量初篩的方法，經(jīng)初篩為陽性的目標菌再通過生化鑒定等金標準方法進行確證，這樣會大大提高目標菌的發(fā)現(xiàn)率。

2.6 血清和MLST分型結(jié)果比較與分析

本次對11株沙門氏菌分別用血清和MLST進行分型，結(jié)果顯示沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性，其中10株菌MLST的預(yù)測結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致，ST11對應(yīng)腸炎沙門氏菌，ST19、ST34和ST29對應(yīng)鼠傷寒沙門氏菌，僅有一株菌（樣品號LHJ-7）MLST分型為ST1628，EnteroBase數(shù)據(jù)庫顯示沒有對應(yīng)的預(yù)測血清型，其血清學(xué)分型結(jié)果為里定沙門氏菌，可能由于該菌株在某一MLST基因位點上有突變導(dǎo)致與血清學(xué)結(jié)果偏差。以血清分型方法為參照方法，本次實驗MLST對沙門氏菌分型的準確度為90.9%（10/11）。

血清學(xué)與MLST在沙門氏菌分型上均表現(xiàn)出較好的鑒定能力，但血清分型操作相對復(fù)雜，對實驗人員操作經(jīng)驗有一定要求，其檢測結(jié)果受制于試劑質(zhì)量，目前各廠商血清質(zhì)量參差不齊，部分菌株由于變異存在無法分型或交叉凝集等錯誤結(jié)果。相比較于血清學(xué)分型，MLST分型具有操作相對簡單、成本低、實驗用時短、結(jié)果更加精準的優(yōu)勢。如將MLST與血清分型聯(lián)合使用，先通過MLST對菌進行血清型預(yù)測，再有針對性的進行血清學(xué)分型實驗，將會極大提高血清分型的效率，尤其對于一些不常見的血清型，往往需要全套的診斷血清進行分型，如果有血清預(yù)測結(jié)果，也會降低對血清試劑的依賴，降低實驗成本。

3 結(jié)論

文章對生雞肉樣品進行沙門氏菌分離鑒定與分型，共分離出疑似沙門氏菌15株，同時采用API生化及質(zhì)譜兩種方法對沙門氏菌進行鑒定，共鑒定出11株沙門氏菌，結(jié)果顯示生化與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。分別采用血清學(xué)和MLST兩種方法對11株沙門氏菌進行分型，結(jié)果顯示MLST共測出5種ST型，血清分型為3種。通過結(jié)果比較得出沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性，其中10株菌MLST的預(yù)測結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致。

質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點，文章僅使用儀器自帶數(shù)據(jù)庫對沙門氏菌進行屬水平的鑒定，如果通過自建數(shù)據(jù)庫，可以對沙門氏菌進行種和亞種水平的鑒定，同時還具有良好的分型能力，可以作為沙門氏菌快速鑒定的一種補充方法。MLST操作簡單，能快速得到結(jié)果并且便于不同實驗室結(jié)果之間的比較，已經(jīng)用于多種細菌的流行病學(xué)監(jiān)測和進化研究。隨著測序速度的加快、成本的降低以及分析軟件的發(fā)展，MLST有望成為細菌的常規(guī)分型方法。