何立群，袁婧，張舒云

（諸暨市人民醫(yī)院病理科，浙江諸暨311800）

宮頸癌是全球女性第4 大常見癌癥[1]。早期發(fā)現(xiàn)可顯著降低宮頸癌患者治療難度，延長生存時間[2]。上個世紀(jì)，以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)的宮頸篩查在降低宮頸癌發(fā)病率和病死率方面取得了較大成功[3]。目前，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查是臨床常用的篩查宮頸癌危險人群的方法之一，特異性較高[4]。

MicroRNA（miRNAs）作為重要的基因調(diào)節(jié)因子，參與多種細(xì)胞內(nèi)通路的調(diào)節(jié)[5]。而通過檢測宮頸脫落細(xì)胞miRNAs 的表達(dá)來評估宮頸癌的相關(guān)報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-508-3p（miR-508-3p）上調(diào)對宮頸癌細(xì)胞的形成及肺轉(zhuǎn)移有抑制作用，miR-508-3p 在宮頸癌中發(fā)揮抑癌基因作用[6]?；A(chǔ)研究證實ROCK1 與宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲有關(guān)[7]。為進(jìn)一步明確miR-508-3p、ROCK1 在宮頸癌中的表達(dá)及其診斷價值，本研究檢測宮頸脫落細(xì)胞（正常、宮頸上皮內(nèi)瘤、宮頸癌）miR-508-3p、ROCK1 的表達(dá)水平，對兩者的相關(guān)性、靶向關(guān)系進(jìn)行探討，并分析其與宮頸癌病理特征的關(guān)系，評估其對宮頸癌的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-2019年9月諸暨市人民醫(yī)院收集的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本172 例。其中正常組（病理檢查正常）70 例，年齡32～60 歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變組（病理學(xué)檢查為宮頸上皮內(nèi)瘤變[8]）54 例，年齡34～57 歲；宮頸癌組（病理學(xué)檢查為宮頸癌[8]）48 例，年齡31～55 歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有受試者自愿參與實驗且配合度較好。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)通過宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查，宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；宮頸癌患者實施手術(shù)治療；臨床資料完整[包括年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、宮頸癌的國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 （International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型]。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)術(shù)前行放化療、宮頸手術(shù)及子宮切除等治療；宮頸不完整；患其他惡性腫瘤；年齡＜30 歲，或＞65 歲；孕婦或妊娠期女性；生殖道炎癥性疾病[9]。

1.3 主要儀器與試劑

Trizol、PrimeScript RT 試劑盒、RNA 酶抑制劑由丹麥DAKO 公司提供，免疫顯色試劑miR-508-3p、ROCK1、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計，離心機由上海精密儀器儀表有限公司提供，酶標(biāo)儀由上海沃元科技有限公司提供，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 儀由杭州艾康生物技術(shù)有限公司提供，免疫組織化學(xué)試劑盒購自瑞士羅氏公司，ROCK1、GAPDH 相關(guān)抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.4 qRT-PCR

提取總RNA。將收集的全部宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本保存于含細(xì)胞保存液的離心管中，離心棄上清液，加入Trizol 溶液，用移液槍反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至滅菌管中，放置10 min，加入0.2 ml 氯仿，混勻后冰上靜置30 min，離心棄上清液，再轉(zhuǎn)移至滅菌管中，加入等量的異丙醇，混勻后冰上靜置15 min，離心棄上清液，加入75%乙醇焦碳酸二乙酯水溶液1 ml，混勻后離心棄上清液，倒置在吸水紙上吸干，加入10 μl DEPC 水溶液，冰上靜置30 min 使RNA 充分溶解，或置入-80℃冰箱冷凍保存待用。再采用StemloopRT 法（反應(yīng)體系：PrimeScript RT enzyme 0.8 μl，PrimeScript RT Buffer 2.0 μl，RNA 酶抑制劑0.2 μl，各基因RT 引物0.2 μl）在PCR 儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)條件：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min，4℃持續(xù)。qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共計40 個循環(huán)。其中miR-508-3p 以U6 為內(nèi)參，ROCK1以GAPDH 為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 免疫組織化學(xué)

將收集的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本制成細(xì)胞薄片，通過免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物-過氧化物酶法檢測ROCK1 蛋白。ROCK1 蛋白免疫組織化學(xué)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：ROCK1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈黃色或棕黃色表達(dá)。ROCK1 蛋白陽性表達(dá)率（%）=ROCK1 陽性細(xì)胞/全部脫落細(xì)胞×100%。

1.6 Western blotting

提取各標(biāo)本中總蛋白，將提取出的蛋白100℃煮沸5 min，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白室溫密封1 h，加入一抗（1∶1 000 稀釋）ROCK1 及GAPDH 4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，顯色，暗室曝光，采用ImageJ 2x 軟件分析灰度值。

1.7 熒光素酶報告實驗

通過http：//www.targetscan.org 網(wǎng)站預(yù)測miR-508-3p 和ROCK1 的靶向關(guān)系，以及miR-508-3p 與ROCK1 3'-UTR 的結(jié)合位點。合成含miR-508-3p 結(jié)合位點的ROCK1 3'-UTR 啟動子區(qū)序列，構(gòu)建ROCK1 3'-UTR 野生型（wild type, WT）質(zhì)粒（ROCK1-WT）。并在該質(zhì)粒基礎(chǔ)上構(gòu)建ROCK1 3'-UTR 突變型（mutant type, MUT）質(zhì)粒（ROCK1-MUT）。參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。將ROCK1-WT、ROCK1-MUT 質(zhì)粒分別與mimics NC、miR-508-3p mimics 質(zhì)?；靹蚝蠊厕D(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后通過熒光素酶試劑盒測定熒光素酶活性。

1.8 臨床病理資料分析

查閱并統(tǒng)計行宮頸癌手術(shù)患者的年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型（鱗癌及腺癌）。參照miR-508-3p 及ROCK1中位值將宮頸癌患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，對上述兩種基因與宮頸癌病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析。全部宮頸癌患者隨訪1年，統(tǒng)計其生存、死亡例數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，方差分析的兩兩比較用SNK- q法；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-508-3p及ROCK1的表達(dá)

正常組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組、宮頸癌組脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與正常組比較，宮頸癌組和宮頸上皮內(nèi)瘤變組miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與宮頸上皮內(nèi)瘤變組比較，宮頸癌組miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表2和圖1、2。

表2 各組宮頸脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1比較

圖1 各組宮頸脫落細(xì)胞中ROCK1的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

圖2 各組宮頸脫落細(xì)胞ROCK1蛋白的表達(dá)

宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組miR-508-3p 與ROCK1 mRNA 均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6678 和-0.5234，均P=0.000）。見圖3、4。

圖3 宮頸癌組miR-508-3p與ROCK1 mRNA的相關(guān)性散點圖

圖4 宮頸上皮內(nèi)瘤變組miR-508-3p與ROCK1 mRNA的相關(guān)性散點圖

ROCK1是miR-508-3p 的預(yù)測靶基因（見圖5）。ROCK1-WT 中，miR-508-3p mimics 組與mimics NC組熒光素酶活性分別為（0.47±0.02）和（0.99±0.05），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.724，P=0.000），miR-508-3p mimics 組較低。ROCK1-MUT中，miR-508-3p mimics 組與mimics NC 組熒光素酶活性分別為（1.01±0.03）和（0.97±0.01），經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.190，P=0.093）。

圖5 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測miR-508-3p與ROCK1的靶向關(guān)系

2.2 miR-508-3p、ROCK1 表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO 分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-508-3、ROCK1 表達(dá)水平比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而不同年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、病理類型患者的miR-508-3p、ROCK1 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各臨床病理特征宮頸癌患者miR-508-3p和ROCK1表達(dá)水平比較 [n=24，例（%）]

2.3 miR-508-3p、ROCK1 診斷宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變的ROC曲線

miR-508-3p 診斷宮頸癌的ROC 曲線下面積（area under curve, AUC）為0.946，敏感性為87.1%，特異性為100.0%，約登指數(shù)為0.871。miR-508-3p診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的AUC 為0.851，敏感性為84.3%，特異性為79.6%，約登指數(shù)為0.639。見表4和圖6。

ROCK1 診斷宮頸癌的AUC 為0.949，敏感性為89.6%，特異性為100.0%，約登指數(shù)為0.896。ROCK1診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的AUC 為0.905，敏感性為77.8%，特異性為88.6%，約登指數(shù)為0.663。見表4和圖6。

圖6 miR-508-3p、ROCK1診斷宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變的ROC曲線

表4 miR-508-3p、ROCK1診斷宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變的ROC曲線參數(shù)

2.4 生存組和死亡組脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1的表達(dá)

隨訪1年后，48 例宮頸癌患者中生存42 例，死亡6 例。生存組與死亡組miR-508-3p 和ROCK1 mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），生存組miR-508-3p 高于死亡組，ROCK1 mRNA 相對表達(dá)量低于死亡組。見表5。

表5 生存組與死亡組脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

約90%宮頸癌死亡患者處于低收入和中等收入國家，特別是在艾滋病流行率較高的地區(qū)，這主要是由于預(yù)防、篩查機會及治療選擇有限[10]。目前僅憑細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變作為診斷依據(jù)難以滿足大面積宮頸癌篩查的需求[11]。隨著基因篩查、分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)等生物醫(yī)學(xué)工程的不斷發(fā)展，宮頸癌標(biāo)志物的篩選及其靶向治療的探索已成為臨床研究的焦點[12]。

miRNAs 是一類小分子非編碼RNA 序列，參與多種重要的生物學(xué)行為，在多種惡性腫瘤中均有miRNA 異常表達(dá)[13-16]。miR-508-3p是一種抑癌基因，在大腸癌[17]、乳腺癌[18]及胃癌[19]中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-508-3p 可對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及增殖發(fā)揮調(diào)控作用，可作為腫瘤性疾病的潛在治療靶點。HU 等[6]研究報道，miR-508-3p 在宮頸癌細(xì)胞和細(xì)胞系中呈異常低表達(dá)，其高表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。ROCK1 作為Rho 家族成員，可通過Rho/ROCK 信號通路激活反向相關(guān)信號分子，參與癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，ROCK1 可結(jié)合活化的Rho 蛋白，促使ROCK1 催化活性中心，誘導(dǎo)癌細(xì)胞肌動蛋白骨架重組，從而增強癌細(xì)胞運動能力[20]。現(xiàn)階段關(guān)于miR-508-3p、ROCK1 與宮頸癌關(guān)系的研究多集中于病變組織檢測或血清檢查，而miR-508-3p、ROCK1 在宮頸脫落細(xì)胞中的檢測尚未見研究報道。

自巴氏以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)創(chuàng)立的涂片宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查被應(yīng)用于宮頸癌的篩查，宮頸癌患病率及病死率明顯降低[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，血清[22]、唾液[23]及尿液[24]等樣本中能檢測到miRNAs。相較于血清標(biāo)本，宮頸脫落細(xì)胞miRNA 的表達(dá)更具有特異性。因此本研究通過檢測健康人群、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1 的表達(dá)，分析兩者與宮頸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，miR-508-3p 相對表達(dá)量在正常組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組及宮頸癌組中依次遞減，說明當(dāng)miR-508-3p 呈低表達(dá)趨勢時，宮頸病變越嚴(yán)重，而ROCK1 表達(dá)與之相反，同時暗示兩者存在一定的負(fù)調(diào)控關(guān)系。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組miR-508-3p 與ROCK1 mRNA 均呈負(fù)相關(guān)，推測miR-508-3p 可能通過靶向負(fù)調(diào)控ROCK1 的表達(dá)，參與宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展。熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，miR-508-3p 可能通過介導(dǎo)ROCK1 的表達(dá)來調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，進(jìn)而對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起到一定的調(diào)控作用，而關(guān)于兩者與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為作用機制的研究有待進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，miR-508-3p、ROCK1 表達(dá)水平與宮頸癌患者的FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑及病理類型無關(guān)。提示宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞miR-508-3p 表達(dá)水平越低，ROCK1 表達(dá)水平越高時，患者病情惡化越嚴(yán)重。這對宮頸癌的早期診斷具有一定的輔助意義。ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-508-3p 和ROCK1診斷宮頸癌的AUC 分別為0.946 和0.949；miR-508-3p 和ROCK1 診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的AUC 分別為0.851 和0.905，說明兩者在宮頸癌的篩查中具有較好的診斷價值。隨訪1年后，生存組miR-508-3p高于死亡組，ROCK1 mRNA 相對表達(dá)量低于死亡組，說明兩者對預(yù)后有預(yù)測作用。

綜上所述，宮頸脫落細(xì)胞miR-508-3p、ROCK1 在宮頸癌患者中表達(dá)異常，其中miR-508-3p 下調(diào)，ROCK1 上調(diào)，兩者呈靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系，并與宮頸癌患者FIGO 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有一定的宮頸癌診斷價值，可作為早期宮頸癌篩查的潛在生物學(xué)指標(biāo)。