任 崢，鄒翠美

全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)在中國兒童及新生兒患者檢出率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，引起醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的高度關(guān)注。不同地區(qū)CRKP分布的病區(qū)不同、產(chǎn)生的碳青霉烯酶類型不同，可能與各地區(qū)使用抗菌藥物品種不同有關(guān)[2]，特別是新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中抗菌藥物應(yīng)用級別高，影響新生兒腸道正常菌群定植；患兒由于免疫力較低更容易感染[3]，死亡率高[4-5]。本文研究某醫(yī)院內(nèi)患兒感染CRKP的分子流行特征，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來源：收集某三甲醫(yī)院2015-2017年NICU檢出的CRKP 11株，均分離自新生兒患者，年齡2 d～3個月。9株來自痰標(biāo)本，1株來自血液，1株來自氣管導(dǎo)管末端標(biāo)本，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株。

1.1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏實驗：用美國BD Phoenix100全自動細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)，PCR實驗儀器所用美國伯樂S1000基因擴(kuò)增儀。

1.1.3 培養(yǎng)基及抗菌藥物：哥倫比亞瓊脂和Mueller-Hinton瓊脂購自O(shè)XOID公司，藥敏紙片購自O(shè)XOID公司，復(fù)核使用的亞胺培南E-test條和美羅培南E-test條購自溫州康泰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗：參照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定11株菌對14種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果判讀按照CLSI-M28折點標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603(產(chǎn)SHV型)。

1.2.2 碳青霉烯酶表型及基因型檢測：3'-氨基苯硼酸(APB)和EDTA協(xié)同試驗表型檢測肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶。含EDTA或APB亞胺培南與單藥抑菌圈直徑相差≥5 mm，提示產(chǎn)金屬酶或KPC型碳青霉烯酶。PCR法擴(kuò)增碳青霉烯酶(KPC、 NDM、IPM、VIM)、AmpC酶(MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX)、ESBL(CTX-M、OXA)和TEM型內(nèi)酰胺酶基因，所用引物參考文獻(xiàn)[6-8]。PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)DNA測序后在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上BLAST進(jìn)行比對。

1.2.3 多位點序列分型(MLST)采用PCR擴(kuò)增11株CRKP的7個管家基因：ropB，gapA，mdh，pgi，phoE，infB，tonB，引物參見網(wǎng)站(http://bigsdb.web.pasteur,fr./klebsiella/klebsiella.html)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測序后與網(wǎng)站標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法： 數(shù)據(jù)分析使用WHONET 5.6軟件進(jìn)行分析，采用描述性統(tǒng)計方法。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌藥敏試驗：11株CRKP對14種常用抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表1。11株CRKP對多粘菌素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素100%敏感，但對頭孢菌素類、碳青霉烯酶類藥物100%耐藥，僅有1株對氨曲南敏感。

表1 11株CRKP標(biāo)本對常用抗菌藥物的藥敏試驗(MIC)

2.2 細(xì)菌耐藥基因表型及基因型及多位點序列結(jié)果:11株CRKP對3'-氨基苯硼酸(APB)和EDTA協(xié)同試驗的結(jié)果見表2?；蛐图岸辔稽c序列結(jié)果見表3。11株菌顯示均產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和金屬酶。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶有blaCTX-M(CTX-M-65、CTX-M-3、CTX-M-15)，金屬酶有NDM-16、NDM-5、Imp-34、Imp-4型。MLST結(jié)果顯示，其中8株菌是ST17型，2株ST357型，1株ST2740型。

表2 11株CRKP對3'-氨基苯硼酸(APB)和EDTA協(xié)同試驗結(jié)果

表3 11株CRKP的基因型及多位點序列結(jié)果

3 討論

碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)等特點，是新生兒科治療新生兒重癥感染的主要防線。我院碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)主要是以肺炎克雷伯菌為主，也主要分布在新生兒科。從臨床資料顯示，10例CRKP是剛?cè)胱ICU未使用抗菌藥物之前送檢微生物標(biāo)本而檢出，其中9例是痰，1例是靜脈血；1例氣管導(dǎo)管末端是入院48 h后送檢微生物標(biāo)本中檢出的。11例患兒中有2例痰培養(yǎng)陽性，1例血流感染的患兒放棄治療出院。8例患兒好轉(zhuǎn)出院。從抗菌藥物使用情況分析，7例患兒未有針對性治療CRKP，可能是定植，定植率64%。有報道稱碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)可通過母嬰傳播途徑在極低體重出生兒體內(nèi)定植，隨后發(fā)生感染，母嬰傳播也是極低出生體重兒發(fā)生CRKP定植的危險因素[9]。本研究提示，在新生兒科進(jìn)行CRE主動篩查，及時監(jiān)測耐藥菌的出現(xiàn)及分子流行病學(xué)特征，對避免耐藥菌在新生兒傳播甚至是暴發(fā)流行具有重大意義。

11株CRKP菌株藥敏結(jié)果顯示，新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中對β-內(nèi)酰胺類及酶抑制劑復(fù)方制劑和碳青霉烯酶類藥物未見敏感菌株；對多黏菌素、環(huán)丙沙星、阿米卡星高度敏感，原因是這類藥物特定的不良反應(yīng)而少用或禁用于兒童。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，兒童群體碳青霉烯類耐藥原因主要是產(chǎn)金屬酶，有攜帶blaNDM-1的肺炎克雷伯菌在新生兒中暴發(fā)流行的報道[10]。產(chǎn)NDM-1酶菌株通常攜帶其他耐藥基因，新型酶抑制劑阿維巴坦對其無效，在治療上更加棘手，預(yù)后更差。本研究收集兒童患者體內(nèi)分離的11株CRKP，全部產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，多為blaCTX-M-15、blaCTX-M-65 blaCTX-M-3型，未檢出產(chǎn)KPC酶、OXA-48 和AmpC酶；11株所攜帶的碳青霉烯酶全部是金屬酶，主要是NDM-5，還有Imp-34、Imp-4、NDM-16、型。根據(jù)MLST分型的結(jié)果分析，在我院新生兒科主要流行株是ST17型，與上海朱俊英報道的型別不同。