劉彩云，劉麗芳，郭利芳，馬艷茹

腦卒中是一種常見的急性腦血管疾病，是腦部血管破裂或者血管阻塞使得血液不能流入大腦，從而導致腦組織損傷的一類疾病，具有高發(fā)病率高致死致殘率的特點[1-2]。微小RNA，即microRNA(miRNA)是近些年發(fā)現(xiàn)的一類長度為19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA[3-6]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-298在缺血性腦卒中大鼠的外周血和腦組織中表達上調[7]，然而，miR-298在缺血性腦卒中患者中的表達以及其與缺血性腦卒中發(fā)病是否有關尚未見文獻報道。本研究通過比較缺血性腦卒中患者和正常對照外周血中miR-298的表達差異，探討miR-298的表達水平與缺血性腦卒中嚴重程度的相關性及其作為評估缺血性腦卒中患者發(fā)病風險生物標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2019年4月-2019年12月我院神經內科收治的65例缺血性腦卒中患者為觀察組，選取同期體檢健康人群50例為健康對照組。健康對照組中男性31例，女性19例，平均年齡(56±7.8)歲；觀察組男性39例，女性26例，平均年齡(55±9.1)歲。2組間性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。缺血性腦卒中的診斷按照WHO國際疾病分類標準(第九版)診斷標準[8]進行，患者至少有一項神經癥狀，同時經影像學檢查發(fā)現(xiàn)卒中病灶。排除標準包括：①有腦卒中病史；②合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及心梗；③心肺肝腎功能不全；④嚴重呼吸系統(tǒng)感染。健康對照組采用體檢、生化指標檢查和調查問卷的方式排除腦卒中病史、惡性腫瘤、神經系統(tǒng)疾病等。本研究經寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會的批準，并獲得了所有研究對象的書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集： 通過抽取研究對象的空腹靜脈血5 mL，并迅速保存于-80 ℃，用于抽提總RNA。缺血性腦卒中患者入院后24 h內抽取外周血。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測：取200 μl外周血，利用miRNA提取試劑盒(康維世紀，貨號：CW0627)提取miRNA，然后按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(康維世紀，貨號：CW2141)的說明書進行反轉錄。采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(康維世紀，貨號：CW2142)檢測miR-298的表達。Real-time PCR擴增在ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific，美國)儀器上進行。U6 snRNA為內參，每個樣品同時檢測3個復孔。microRNA-298的相對表達量用公式2ΔΔCt進行計算。引物序列如下：miR-298 forward,5’-ACACTCAGCTGGGAGCAGAAGCAGGGAG-3’;reverse,5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3’和U6 forward,5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’;reverse,5’-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3’。

1.3 觀察指標：①觀察2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率；②觀察2組血糖、血脂水平；③觀察2組miR-298的相對表達量。

2 結果

2.1 2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率比較：觀察組高血壓發(fā)生率高于健康對照組，而吸煙率以及糖尿病、高血脂發(fā)生率2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組吸煙及伴發(fā)疾病發(fā)生率比較[n(%)]

2.2 2組血糖、血脂水平比較：2組血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白水平面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；觀察組總膽固醇、低密度脂蛋白水平高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 2組患者血糖、血脂水平比較

2.3 miR-298在缺血性腦卒中和健康對照組中的表達情況及其與缺血性腦卒中發(fā)病風險間的關系：檢測發(fā)現(xiàn)，miR-298在缺血性腦卒中患者和健康對照中的相對表達量分別為1.559±0.08和1.942±0.09，miR-298在觀察組中的表達顯著高于在對照組(P<0.05)，見圖1(目錄后)。此外，Logistic回歸分析結果顯示，miR-298的高表達增加了缺血性腦卒中發(fā)病的風險(OR=1.82,95%CI=1.10～2.81;P<0.05)，經性別、年齡、高血壓、高血脂、吸煙等傳統(tǒng)風險因素校正后，miR-298的高表達仍然與缺血性腦卒中發(fā)病的風險有關(OR=2.01,95%CI=1.05～3.36;P<0.05)。結果表明缺血性腦卒中患者的外周血miR-298的表達水平較健康對照組顯著升高(P<0.05)，并且與缺血性腦卒中發(fā)病風險顯著相關。

3 討論

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，他們可通過作用于靶基因從而發(fā)揮生物學功能。大量研究表明，miR-298的異常表達與人類腫瘤和阿爾茨海默癥的發(fā)生密切相關[9-10]。LIU等人利用基因芯片發(fā)現(xiàn)了miR-298在缺血性腦卒中患者中高表達[7]。然而，miR-298在缺血性腦卒中患者中的表達以及其與缺血性腦卒中發(fā)病是否有關尚未見文獻報道。因此，本研究通過比較miR-298在缺血性腦卒中患者和健康對照中的表達，以評價其對缺血性腦卒中診斷和預后的價值。

由于miRNA在外周血中的含量相對較低，因此real-time PCR便成為檢測外周血miRNA檢測的有效手段[11]。本研究利用real-time PCR比較了65例缺血性腦卒中患者及50例健康對照組外周血中miR-298的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-298在缺血性腦卒中患者外周血中的表達水平顯著高于其在健康對照組中的表達水平。此外，Logistic回歸分析結果顯示，miR-298的高表達增加了缺血性腦卒中發(fā)病的風險。研究結果進一步證實了miR-298與缺血性腦卒中的發(fā)生相關。在缺血性腦卒中患者中，miR-298是否也通過作用于其靶基因Act1發(fā)揮作用，仍有待進一步研究。

本資料所有研究對象均為中國漢族人群，并且按照嚴格的排除和納入標準進行，同時，觀察組和健康對照組的性別和年齡相匹配。然而，本研究仍然存在以下不足之處：①樣本例數(shù)較少，各臨床資料在2組間分布不均，結果可能存在一定的偏倚性，因此，后期有必要繼續(xù)擴大樣本量進一步研究miR-298在缺血性腦卒中患者中的作用；②需要利用生物信息學分析和功能實驗驗證miR-298在缺血性腦卒中發(fā)生中的靶基因，以明確miR-298參與缺血性腦卒中的分子機制。