鄭美青 薛 冰 趙淑銳 宋學英

(首都醫(yī)科大學，北京 100069)

血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中有重要作用。血小板的主要生理功能是參與止血與血栓形成。正常血液中的血小板處于“靜息”狀態(tài)，呈圓盤狀，當血小板受到一定刺激時就會被活化[1]，膜空間構形發(fā)生改變，血小板表面GPⅡb-Ⅲa 復合物的纖維蛋白原受體位點暴露，這些受體與血液中的纖維蛋白原結合而導致血小板聚集[2-4]。

在血小板的活化研究中，國內外較普遍的研究方法是利用流式細胞儀對血小板活化后分泌的物質進行檢測，該方法雖然可以對血小板分泌的物質進行定量檢測，但缺乏確鑿的影像學支持[5-8]。

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反饋控制系統(tǒng)的作用下，根據微小探針與樣品間的相互作用，去感觸樣品表面形貌的變化，就如同人在大腦地控制下，用手去感觸物體表面形貌[9]。原子力顯微鏡作為生物成像研究中的有力工具, 目前已經在生物材料的研究領域中得到了廣泛的應用[10，11]。用原子力顯微鏡觀察血小板的形貌變化實驗中，經常會遇到制樣技術的不成功直接導致實驗失敗。因為血小板在采集、保存過程中受多種因素影響，其代謝和生理活性很容易發(fā)生改變和活化，因此，血小板的制樣方法至關重要，本文主要討論血小板制樣技術對原子力顯微鏡成像結果的影響。

1 實驗試劑與儀器

實驗所用儀器是Bruker Multimode 8 原子力顯微鏡，探針SNL-A、云母片和硅片均購于某公司。

2 以云母和硅片為基底的血小板制樣

在原子力顯微鏡成像中最常用的基材是白云母，一種常見的層狀硅鋁酸鹽，層與層間易解離，而解離后具有原子級的平整度，它提供高度帶負電荷的表面，且天然親水。云母晶體顯示出很大程度的基礎分裂，使其可以分裂成原子平坦的薄片，所以常被用作基底材料[12]。

硅片也是原子力顯微鏡常用的基底之一，新購買的硅片可以直接制樣，使用后的硅片一般要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3混合液在70℃煮1h，或者用酒精清洗之后方可制樣。

(1)采集健康SD大鼠的頸動脈血，加入3.8%的枸櫞酸鈉溶液抗凝(血與抗凝劑體積比9∶1)，1000 rpm/min離心10分鐘，沉淀血細胞，取上清得到富血小板血漿(PRP)。PRP于3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清得血小板固體。加入生理鹽水清洗血小板，用滴管將血小板吹打均勻后，3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清保留固體。再重復清洗2～3次，得到未活化的血小板。再次加入生理鹽水稀釋，調整血小板計數(shù)濃度為1×105個/mL。

(2)取上述血小板懸液400μL，加入100μL生理鹽水，孵育30 分鐘(37℃)，得到未活化血小板。吸取所制得的樣品溶液100μL依次滴到云母片和硅片上，5分鐘后，用濾紙吸掉部分溶液，每個樣品上滴30μL3%戊二醛溶液，固定10分鐘，然后加100μL超純水重復洗滌云母片和硅片3次，晾干后得樣1和樣2，用雙面膠粘在樣品碟上等待檢測。

(3)取第1步所得血小板懸液400μL，孵育30分鐘(37℃)，加入100μL 3%戊二醛溶液，4℃固定2h，3000 rpm/min離心10分鐘，棄上清繼續(xù)超純水清洗3次，3000 rpm/min離心10分鐘得固定后的血小板固體。加入500μL超純水，滴管吹打均勻后，吸取溶液100μL依次滴在云母片和硅片上，晾干得樣3和樣4，用雙面膠粘在樣品碟上等待檢測。

(4)采用Bruker multimode 8原子力顯微鏡，探針SNL-A，接觸模式成像，結果見圖1。

圖1 樣1～樣4的AFM成像圖圖A～D依次為樣1～樣4的AFM成像圖

首先采用了先點樣后固定的方法，分別以云母和硅片為基底，制得樣1和樣2，得到了成像圖A和B。為排除血小板在定容、點樣等過程中受激，我們又嘗試先固定后點樣的方法，分別以云母和硅片為基底，制得樣3和樣4，得到了成像圖C和D。

由圖1可見，選用上述哪種制樣方法，并分別選用云母片和硅片兩種基底，在所測得的AFM成像圖中，單個血小板都呈扁平圓盤狀, 表面比較平滑，無偽足。由此推斷，兩種制樣方法，兩種基底，都可以用來完成血小板制樣，得到很好的形貌圖，給血小板的研究提供確鑿的影像學支持。

3 制樣過程中的其他影響因素

(1)循環(huán)血液中血小板基本處于靜息狀態(tài)，在制樣過程中，因各種因素的作用，血小板很容易受到刺激而成為活化血小板發(fā)揮聚集作用[13]。因此整個血小板的制樣過程中動作必須要輕柔，防止過度刺激活化血小板。圖2為過度活化的血小板，在AFM下血小板大多呈聚集狀態(tài), 彼此間大多有偽足相連[14]。

圖2 過度活化的血小板成像

圖3 樣品表面被破壞的AFM成像

(2)AFM測樣時，基底表面需要非常平整，因此在點樣時要一次性把溶液均勻鋪滿整個基底，避免用槍頭在樣品表面劃來劃去，圖3深色區(qū)域為槍頭劃過的痕跡，因樣品表面不平整，直接影響血小板的成像。

圖3 樣品表面被破壞的AFM成像

(3)實驗取血中所用到的離心管、槍頭和吸管必須提前做好硅烷化處理[15]，如果硅烷化不完整，或者動作不夠輕柔，會引起紅細胞破裂發(fā)生溶血現(xiàn)象，圖4為溶血后的AFM成像，圖中箭頭所示為血小板成像，效果與圖1相近，但可以清晰看到視野中布滿了大量的紅細胞的碎片，嚴重影響血小板的AFM成像圖。

圖4 溶血后的AFM成像

(4)實驗中需要將云母片和硅片粘在樣品碟上，所選用的膠一定不能是水溶性的，也不能遇水膨脹，否則會導致Z Piezo一直向Retracted方向飄，見圖5，無法正常成像。

圖5 Z Piezo向Retracted方向飄移

(5)云母在揭掉時一定要一整層揭掉，透明膠帶粘滿云母表面，一定要檢查是否是整層，如果撕裂或者不平整，見圖6，樣品不能均勻分布在云母表面，直接影響最后的成像效果。另外，基底不能太薄，如果選用云母為基底，太薄的云母會導致聚焦困難，同樣會影響最終的成像效果。

圖6 撕裂的云母表面

(6)需要注意探針的清潔，如果探針不小心被污染，可以用乙醇/異丙醇(EtOH/IPA)浸泡探針，紫外燈照射，必要時用plasma處理[16]。

4 結論

循環(huán)血液中血小板基本處于靜息狀態(tài)，在各種理化和生物因子的作用下，血小板受到刺激而成為活化血小板發(fā)揮聚集作用。血小板在采集、保存過程中受多種因素影響，其代謝和生理活性很容易發(fā)生改變和活化。

為了提高血小板制樣的成功率，本文總結了不同的制樣方法及實驗中常見的影響因素。分別選用云母片和硅片基底，首先采用了先點樣后固定的制樣方法，為排除血小板在定容、點樣等過程中受刺激，又嘗試先固定后點樣的制樣方法。成像結果顯示，無論是選用先點樣后固定的方法，還是選用先固定后點樣的方法，都可以得到很好的血小板成像圖，因此這兩種方法都可以用來完成血小板的制樣。但在血小板的制樣過程中，還有很多關鍵因素會影響最后成像，如硅烷化不完整引起的溶血，動作不夠輕柔引起的血小板過度活化，操作不規(guī)范引起的樣品表面不平整等。因此在AFM對血小板成像的實驗中，應該盡量避免上述操作不當影響最后實驗結果，為血小板的研究提供有力的影像學支持。