馬雨璇 王 娜 李 鋼

(南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院, 分析測(cè)試中心, 南京 210023)

慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率與日俱增，患者普遍伴隨著鈣磷代謝紊亂問(wèn)題，腎臟排磷量顯著減少會(huì)導(dǎo)致高磷血癥。高磷血癥是維持性血液透析患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已經(jīng)成為慢性腎疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥[1，2]。傳統(tǒng)的鋁鹽和鈣鹽磷結(jié)合劑由于其毒副作用大，已經(jīng)被棄用。鑭是稀土中的陽(yáng)離子元素，以三價(jià)形式(La3+)存在，對(duì)羧基和磷酸基具有較強(qiáng)的親和力，可與磷酸鹽結(jié)合形成水溶性低的磷酸鑭難溶物。目前被開(kāi)發(fā)成藥物碳酸鑭(LC)，于2004年10月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[3-5]。碳酸鑭主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行抑制，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶來(lái)達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的目的[6]。該復(fù)合鑭鹽在胃腸道吸收少，主要經(jīng)膽汁排泄，少部分經(jīng)腸道排泄，腎臟排泄甚少，所以對(duì)腎病患者不造成腎臟的二次損傷[7，8]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)表明，雖然碳酸鑭與碳酸鈣在磷結(jié)合率上效用相當(dāng)，但是長(zhǎng)期使用鈣類(lèi)磷結(jié)合劑可導(dǎo)致高鈣血癥，增加血液中的鈣磷乘積以及心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[9-12]，而碳酸鑭不僅可降低血液中的鈣磷乘積，還可以減少高鈣血癥和甲狀旁腺激素相關(guān)疾病的發(fā)生。臨床數(shù)據(jù)顯示碳酸鑭耐受性好且副作用少，患者在服用藥物后，血磷水平得到明顯降低，僅少部分出現(xiàn)一些惡心、嘔吐以及便秘的癥狀[13]。與其他磷結(jié)合劑相比，碳酸鑭毒副作用小，結(jié)合率高，不經(jīng)腎排泄，具有廣闊的市場(chǎng)和良好的前景[8]。

基于現(xiàn)有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道并不多，在國(guó)內(nèi)對(duì)該藥物的研究也比較少，需要對(duì)其進(jìn)行深入的研究。碳酸鑭的制作工藝較為復(fù)雜，鑭離子為硬路易斯酸，易與氫氧根離子結(jié)合，制備時(shí)需要控制pH值在酸性條件下，將氯化鑭(LaCl3)溶液倒入碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液中形成晶核，再以晶核為中心逐漸擴(kuò)大形成碳酸鑭結(jié)晶，其中以4個(gè)結(jié)晶水的碳酸鑭(La2(CO3)3·4H2O)結(jié)晶生物利用度最高，藥效最好[14]。若制備過(guò)程中反應(yīng)條件控制不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)碳酸鑭藥物中混有雜質(zhì)晶型堿式碳酸鑭(LaCO3OH)，而美國(guó)FDA從未批準(zhǔn)其用于高磷血癥的臨床治療[14]。為了確保藥品質(zhì)量，需要一種切實(shí)有效的方法對(duì)La2(CO3)3·4H2O和 LaCO3OH進(jìn)行定性分析，其中LaCO3OH有I型和II型兩種晶型。對(duì)于藥物不同晶型的研究通常借助于X-射線粉末衍射法(PXRD)、熱分析法、傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)、掃描電子顯微鏡法(SEM)，在相關(guān)文獻(xiàn)中已有較多報(bào)道[15-17]。本研究主要通過(guò)上述現(xiàn)代分析手段對(duì)La2(CO3)3·4H2O和LaCO3OH的兩種雜質(zhì)晶型進(jìn)行表征，建立了定性和定量分析方法，為我國(guó)將來(lái)仿制藥的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供保障和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

FA2004型電子天平；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵；D/max 2500VL/PC型陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀；JSM-5610型掃描電子顯微鏡；Analysis Diamond熱重分析儀；DHG-9070A(101A-1S)鼓風(fēng)干燥器；VERTEX70 型傅里葉變換紅外光譜儀。

La2(CO3)3·4H2O和LaCO3OH晶型I、II由南京某公司提供。

2 碳酸鑭樣品的定性和定量分析

2.1 定性分析

2.1.1熱重-差熱分析(TG-DTA)

稱(chēng)取樣品約2.0mg 放入鉑金坩堝，將坩堝放入 TGA 中進(jìn)行測(cè)試，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，升溫速率為 10 k·min-1，升溫范圍為 25℃～800 ℃，進(jìn)行熱重分析。

2.1.2傅里葉變換紅外光譜法分析(FTIR)

采用KBr壓片法檢測(cè)樣品，掃描范圍4000 ～ 400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用聚苯乙烯膜校正。

2.1.3掃描電子顯微鏡法分析(SEM)

取樣品粘結(jié)在樣品座上，鍍膜處理后放置于掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。測(cè)定條件：加速電壓8kV，放大倍率2000，樣品臺(tái)直徑30mm。

2.1.4X-射線粉末衍射法分析(PXRD)

測(cè)定條件為管壓：40kV, 管流：100 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接收狹縫(RS) = 0.15 mm。掃描速度:5°·min-1，連續(xù)掃描，掃描范圍3°～ 40°，步寬：0.02°。

2.2 定量分析

2.2.1實(shí)驗(yàn)方法

單峰法[17]。

2.2.2X-射線粉末衍射法分析(PXRD)

測(cè)定條件為管壓：40kV；管流：150 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接收狹縫(RS) = 0.15 mm；掃描速度:1°·min-1；步進(jìn)掃描，掃描范圍10°～ 30°；步寬：0.02°。

2.2.3檢測(cè)限和定量限

利用檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)兩個(gè)指標(biāo)來(lái)測(cè)試峰面積法和峰高法的靈敏度[18]。計(jì)算公式見(jiàn)式(1)和式(2)：

LOD=3.3σ/S

(1)

LOQ=10σ/S

(2)

式中σ為標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用的是標(biāo)準(zhǔn)曲線截距的標(biāo)準(zhǔn)誤差；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。實(shí)驗(yàn)中使用origin軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(峰面積法和峰高法)進(jìn)行計(jì)算和分析。

3 結(jié)果分析

3.1 定性分析

3.1.1熱重-差熱分析

圖1為四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的熱重分析圖譜(A: La2(CO3)3·4H2O、B: LaCO3OH-I、C: LaCO3OH-II)。四水碳酸鑭在高溫下分解主要分為3個(gè)步驟，如式(3)：

La2(CO3)3·4H2O → La2(CO3)3→ La2O2CO3→ La2O3

(3)

如圖1A所示，四水碳酸鑭樣品在25～350℃發(fā)生第一步分解，失去4個(gè)結(jié)晶水分子，失重比例為17.0%，放出熱量141.8J；在350～600℃發(fā)生第二步分解反應(yīng)，失去2個(gè)CO2分子，失重比例為17.1%，放出熱量281.9J；在600～800℃發(fā)生第三步分解反應(yīng)，失去最后1個(gè)CO2分子，失重比例為7.9%，放出熱量540.3J，最后的剩余樣品為L(zhǎng)a2O3。其三步的熱重?fù)p失比例測(cè)量值與理論計(jì)算值基本一致，說(shuō)明該樣品確為四水碳酸鑭，符合其高溫分解式。

堿式碳酸鑭晶型I和II的高溫分解式分為兩步，如式(4)和(5)：

2LaCO3OH → La2O2CO3+ H2O + CO2

(4)

La2O2CO3→ La2O3+ CO2

(5)

如圖1B所示，堿式碳酸鑭晶型I在310～590℃階段發(fā)生第一步分解反應(yīng)，失去1個(gè)H2O分子和1個(gè)CO2分子，失重比例為16.1%，放出熱量382.1J；在590～800℃發(fā)生第二步分解反應(yīng)，失去1個(gè)CO2分子，失重比例為9.3%，放出熱量1190.0J。該失重測(cè)量值與理論計(jì)算值基本一致，符合式(4)和式(5)的分解式。

如圖1C所示，堿式碳酸鑭晶型II在340～580℃階段發(fā)生第一步分解反應(yīng)，同樣也是失去1個(gè)H2O分子和1個(gè)CO2分子，失重比例為17.6%，放出熱量561.8J；第二步分解反應(yīng)發(fā)生在580～800℃時(shí)，失去 1個(gè)CO2分子，失重比例為9.8%，放出熱量722.7J。堿式碳酸鑭晶型II的熱重?fù)p失量符合理論計(jì)算值和分解式。

3.1.2傅里葉變換紅外光譜分析

圖2為四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的FTIR圖(A：La2(CO3)3·4H2O、B: LaCO3OH-I、C: LaCO3OH-II)，表1為堿式碳酸鑭中各官能團(tuán)的紅外特征吸收。由于堿式碳酸鑭中還含有-OH，除了歸屬CO32-的特征峰以外還應(yīng)該含有可歸屬于OH的特征峰位置。

圖2A中各個(gè)吸收峰：3259cm-1處的寬峰為四水碳酸鑭中結(jié)晶水的O-H伸縮振動(dòng)和H-O-H彎曲振動(dòng)所引起的；1470 cm-1和1365 cm-1處歸屬于CO32-基團(tuán)的伸縮振動(dòng)；849cm-1、747cm-1和677cm-1處歸屬于CO32-基團(tuán)的變形振動(dòng)。

根據(jù)文獻(xiàn)[19]可知，堿式碳酸鑭晶體中CO32-的四個(gè)吸收峰主要是在1070～1100 cm-1(ν1)、850～880 cm-1(ν2)、1400～1510 cm-1(ν3)和690～730 cm-1(ν4)處。

圖2B中各個(gè)吸收峰：1499 cm-1和1435 cm-1處的尖峰可歸屬于ν3，1080 cm-1可歸屬于ν1，848 cm-1和872cm-1兩個(gè)吸收峰歸屬于ν2，而70 cm-1處的特征峰歸屬于ν4，它們均是由樣品中的CO32-基團(tuán)的變形振動(dòng)所引起的；3616 cm-1、3485 cm-1處的尖峰歸屬于自由OH的伸縮振動(dòng)，590 cm-1處的尖峰歸屬于OH的彎曲振動(dòng)。以上的吸收峰均是由堿式碳酸鑭晶型I中的各個(gè)官能團(tuán)所引發(fā)的特征吸收，可作為其鑒別的特征峰。

如圖2C所示，1488 cm-1和1421 cm-1處的尖峰可歸屬于ν3，1074 cm-1可歸屬于ν1，858 cm-1和808 cm-1兩個(gè)吸收峰歸屬于ν2，而725 cm-1和697 cm-1處的特征峰歸屬于ν4，它們也是由樣品中的CO32-基團(tuán)的變形振動(dòng)所引起的；3450 cm-1處的尖峰由自由OH的伸縮振動(dòng)引起，未看見(jiàn)低波數(shù)區(qū)的彎曲振動(dòng)。這些吸收峰均是由于堿式碳酸鑭晶型II中的各個(gè)官能團(tuán)所引發(fā)的特征吸收，同樣也可用作其鑒別的特征峰。

表1 堿式碳酸鑭晶型I和II的紅外數(shù)據(jù)

圖2 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的紅外分析圖A. 四水碳酸鑭; B.堿式碳酸鑭晶型I ; C.堿式碳酸鑭晶型II

堿式碳酸鑭晶型II相比于晶型I，其官能團(tuán)所引起的吸收特征峰沒(méi)那么復(fù)雜，少了兩個(gè)自由OH的吸收峰(3616cm-1處OH的伸縮振動(dòng)和590 cm-1處OH的彎曲振動(dòng))?？赡苁怯捎诰徒Y(jié)構(gòu)不同，晶型II中CO32-吸收的貢獻(xiàn)占據(jù)主要部分，其峰強(qiáng)度更高。從圖表中也可以看出堿式碳酸鑭晶型II中的CO32-的特征吸收更強(qiáng)、特征峰更清晰尖銳。

3.1.3掃描電子顯微分析

四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的掃描電鏡微形貌如圖3所示(A：La2(CO3)3·4H2O、B：LaCO3OH-I、C：LaCO3OH-II)。圖3A可以看出四水碳酸鑭的微觀形貌為片層狀；圖3B顯示堿式碳酸鑭晶型I的微觀形貌是大小均勻的顆粒狀；圖3C是堿式碳酸鑭II其微觀形貌為團(tuán)聚在一起大小不一的絮狀。

圖3 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的掃描電鏡圖A. 四水碳酸鑭; B. 堿式碳酸鑭晶型I ; C. 堿式碳酸鑭晶型II

3.1.4X-射線粉末衍射分析

從圖4中可以看出，LaCO3OH的I型和II型與La2(CO3)3·4H2O各自有不同的特征峰。La2(CO3)3·4H2O(A)在2θ=13.4°、18.32°、19.66°、22.92°、23.92°、27.04°和30.34°處有特征峰，2θ=13.4°處為最強(qiáng)峰；LaCO3OH的I型(B)在2θ=17.62°、24.3°、30.22°和35.78°處有特征峰，2θ=30.22°處為最強(qiáng)峰；LaCO3OH的II型(C)在2θ=15.68°、20.26°、20.64°、23.58°、23.9°、26.1°、29.8°、31.84°、33.5°、35.37°、36.54°和37.82°處有特征峰，2θ=29.8°處為最強(qiáng)峰。結(jié)果與PDF卡片基本一致，誤差在±0.2°范圍內(nèi)，可據(jù)此來(lái)鑒別3種晶型。同時(shí)，不同的特征峰也可作為L(zhǎng)aCO3OH的I型和II型與La2(CO3)3·4H2O定量分析的基礎(chǔ)，表2～表4中加粗部分代表后續(xù)定量分析3種晶型所選取的特征峰結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

圖4 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的X射線衍射圖A. 四水碳酸鑭; B.堿式碳酸鑭晶型I ; C. 堿式碳酸鑭晶型II

表2 四水碳酸鑭的PXRD數(shù)據(jù)

表3 堿式碳酸鑭晶型I的PXRD數(shù)據(jù)

表4 堿式碳酸鑭晶型II的PXRD數(shù)據(jù)

3.2 定量分析

將制備好的碳酸鑭和LaCO3OH-I和II樣品分別過(guò)200目篩，使粒徑盡量保持一致便于充分混合減少粒徑所引起的實(shí)驗(yàn)誤差。然后將樣品放置于干燥器中平衡24小時(shí)。通常采用研磨混合的方法來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行混合。在混合前，采用干法分別對(duì)碳酸鑭和兩種堿式碳酸鑭晶型研磨5min、10min和20min，用X射線衍射法對(duì)其進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果表明，3種晶型在不同時(shí)間研磨后均未發(fā)生晶型和物相變化，可以此作為定量分析的基礎(chǔ)標(biāo)樣開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，首選干法研磨混合的方法來(lái)配制用于定量分析的二元混合物實(shí)驗(yàn)樣品，按照表5中所示比例(總量300mg)分別于分析天平上稱(chēng)取LaCO3OH-I、II型和La2(CO3)3·4H2O樣品，配制不同比例混晶體系。再置于瑪瑙研缽中研磨混合20min，分別編號(hào)N1～N15和M1～M15。將配好的混合樣品靜置在干燥器中，備用。

表5 不同比例的碳酸鑭與堿式碳酸鑭的二元混合體系 %

續(xù)表5

由上面的定性分析可知，La2(CO3)3·4H2O的特征峰為13.40°，LaCO3OH-I的特征峰為17.62°，LaCO3OH-II的特征峰為26.10°。將按表5制備好的混合樣品(N1～N15,M1～M15)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定。比例相同的樣品制樣3次，測(cè)定3次，取3次測(cè)試結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。對(duì)測(cè)試得到的結(jié)果分別采用峰高法和峰面積法進(jìn)行積分，結(jié)果如圖5和圖6所示。雜質(zhì)LaCO3OH-I的峰高標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(A)為y = 0.35865x + 0.03026 ，峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(B)為y= 0.12872x+ 0.0072，R2分別為0.95163和0.98431。雜質(zhì)LaCO3OH-II的峰高標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(A)為y= 0.48405x+ 0.01432 ，峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(B)為y= 0.12774x+ 0.00724，R2分別為0.98661和0.98933。由此可得出結(jié)論：兩種雜質(zhì)的定量分析中，峰面積法的線性關(guān)系均優(yōu)于峰高法。

堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測(cè)限和定量限如表6所示，其中采用峰高法計(jì)算出堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測(cè)限和定量限分別為3.06%、9.28%和1.32%、4.01%，峰面積法計(jì)算出堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測(cè)限和定量限分別為1.71%、5.19%和1.18%、3.58%，由此可以看出，建立兩種雜質(zhì)晶型的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是峰面積法更為靈敏。

圖5 LaCO3OH-I與 La2(CO3)3·4H2O二元混合物的強(qiáng)度比與含量的關(guān)系曲線A.峰高法; B. 峰面積法

圖6 LaCO3OH- II與 La2(CO3)3·4H2O二元混合物的強(qiáng)度比與含量的關(guān)系曲線A.峰高法; B.峰面積法

表6 堿式碳酸鑭晶型Ⅰ和Ⅱ的檢測(cè)限和定量限

為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度，配置了不同比例的LaCO3OH-I、LaCO3OH-II與四水碳酸鑭的混合樣品(7%、10%和16%)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，將所得數(shù)據(jù)按同樣的方法計(jì)算出強(qiáng)度比，再分別代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果如表7所示。采用峰高法作出的LaCO3OH晶型I的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度在77.82%～84.13%，峰面積法的準(zhǔn)確度在87.09%～94.51%；采用峰高法作出的LaCO3OH晶型II的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度在83.59%～91.36%，峰面積法的準(zhǔn)確度在88.35%～97.37%。由此可見(jiàn)，兩種晶型均為峰面積法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度高于峰高法。

表7 不同比例的堿式碳酸鑭晶型I和II的準(zhǔn)確度計(jì)算值

4 討論

近年來(lái)，藥物的晶型研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)藥物開(kāi)發(fā)和原研藥仿制的重要內(nèi)容之一，同種藥物可能存在著不同的晶型，導(dǎo)致藥物療效和生物利用度的不同。對(duì)藥物晶型進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征成為臨床用藥的前提，也是藥物穩(wěn)定性考察的基礎(chǔ)和依據(jù)。因此，在對(duì)藥物藥理作用研究前必須建立一系列系統(tǒng)的表征方法，以確保該生產(chǎn)藥物是目標(biāo)藥物。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)熱重分析(TGA)、傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)、掃描電子顯微分析(SEM)和X射線粉末衍射分析(PXRD)等現(xiàn)代分析手段對(duì)樣品進(jìn)行表征，為藥物的定量分析提供參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)四水碳酸鑭及其兩種雜質(zhì)晶型堿式碳酸鑭定性分析的基礎(chǔ)上，建立了基于PXRD單峰法中峰高法和峰面積法的定量分析方法。通過(guò)選取3種晶型的特征峰來(lái)計(jì)算峰高強(qiáng)度比和峰面積強(qiáng)度比，分別得出了兩種堿式碳酸鑭雜質(zhì)在目標(biāo)晶型中含量的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩者都有良好的線性關(guān)系，且峰面積法優(yōu)于峰高法。在X射線衍射的定量分析中，通常每個(gè)物相我們選取一條特征衍射峰來(lái)采集數(shù)據(jù)。該衍射峰和其它物相的衍射峰不可發(fā)生重疊，盡可能選擇獨(dú)立且強(qiáng)度較高的特征峰，另外制樣時(shí)還要避免擇優(yōu)取向等原因造成強(qiáng)度不穩(wěn)定、出現(xiàn)偏差的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用的是干法研磨的手段，在對(duì)二元體系進(jìn)行研磨混合時(shí)，力度要適中，重在混合而非用力研磨，否則會(huì)導(dǎo)致樣品粘附在瑪瑙研缽壁或者研磨棒上，造成數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，偏離真實(shí)值，甚至破壞晶型。由于LaCO3OH-I和LaCO3OH-II的含量較低，應(yīng)一邊研磨混合一邊少量多次加入到La2(CO3)3·4H2O中，這樣可以避免雜質(zhì)樣品結(jié)塊，集中在同一區(qū)域從而造成較大實(shí)驗(yàn)誤差。