劉牧，王巧文，薄海美

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院辦公室，河北 唐山 063000)

白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以無法控制的未成熟骨髓細(xì)胞增殖和存活為特征。腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致治療不理想的重要因素，故研究其耐藥機(jī)制十分必要[1-2]。研究表明，白血病化療耐藥機(jī)制與包括微RNA(microRNA，miRNA/miR)在內(nèi)的多種基因的異常表達(dá)有關(guān)[3-5]。miRNA可在白血病中充當(dāng)腫瘤促進(jìn)因子或抑制因子，影響其病理過程及化療耐藥[3-5]。miR-15b作為miR-15/16家族成員，在胰腺癌、白血病等腫瘤中異常表達(dá)，并參與細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，與腫瘤耐藥密切相關(guān)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b表達(dá)下調(diào)是大多數(shù)人類慢性淋巴細(xì)胞性白血病的標(biāo)志，但目前miR-15b在白血病阿霉素耐藥性中研究的報道較少[8]。本研究通過觀察人白血病K562細(xì)胞和阿霉素耐藥K562/A02細(xì)胞中miR-15b表達(dá)情況，分析miR-15b表達(dá)對K562/A02細(xì)胞增殖、凋亡和阿霉素耐藥性的影響及其機(jī)制，以初步揭示miR-15b與白血病阿霉素耐藥的關(guān)系，以期為白血病耐藥機(jī)制以及新的靶向治療機(jī)制的研究提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 人白血病阿霉素耐藥細(xì)胞系K562/A02和親本細(xì)胞系K562(天津血液研究所)，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗、胎牛血清(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：200612、200905、200207、201019)；Trizol和脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司生產(chǎn)，批號：200723、200916)，二甲基亞砜和噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：200813、200802)；互補(bǔ)DNA第一鏈合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：201103)，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporters，ABC)C5多克隆抗體、β-肌動蛋白單克隆抗體、全蛋白提取試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶公司生產(chǎn)，批號：201103、201030、200930、200815、200621)，pmirGLO熒光素酶報告基因載體(中國BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心生產(chǎn)，批號：200918，貨號：3577193)。流式細(xì)胞儀(美國BD公司生產(chǎn)，型號：FACSCanto Ⅱ )，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國ABI公司生產(chǎn)，型號：7900)，全自動酶標(biāo)儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號：WD-2102B、WD-9413C)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃條件下、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，其中培養(yǎng)K562/A02細(xì)胞時，加入1 mg/L阿霉素維持細(xì)胞耐藥性，實(shí)驗(yàn)前2周停藥培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理 將K562/A02細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(正常培養(yǎng))、miRNA對照(microRNA-NC，miR-NC)組(轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照)、miR-15b組(轉(zhuǎn)染miR-15b模擬物)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按每孔5×105個接種于6孔板常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%時，再參照脂質(zhì)體2000說明書將miR-15b模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組K562/A02細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4檢測miR-15b、ABCC5信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達(dá)水平 采用Trizol法提取K562細(xì)胞或K562/A02細(xì)胞總RNA，隨后將其逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，并以其為模板在20 μL反應(yīng)體系下上熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行擴(kuò)增；將U6和β-肌動蛋白分別作為miR-15b和ABCC5的內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算兩者表達(dá)水平[9]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物(大連寶生物公司合成)序列見表1。

表1 引物序列

1.5MTT檢測 ①檢測細(xì)胞增殖：按照每孔2×105個將已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞種植到96孔板上，而后培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%，根據(jù)1.3中分組轉(zhuǎn)染24、48和72 h后棄培養(yǎng)液；添加20 μL MTT(5 g/L)試劑孵育4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μL二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至結(jié)晶溶解后在450 nm處檢測細(xì)胞吸光度值，K562/A02細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值)×100%，重復(fù)3次。②檢測細(xì)胞耐藥性：胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-15b、miR-NC組和對照組的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后按照每孔105個種植到96孔板上。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 mg/mL阿霉素，其中每個梯度設(shè)3個復(fù)孔；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，先后加入MTT試劑和二甲基亞砜；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)酶標(biāo)儀檢測吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及其對阿霉素半抑制濃度(half-inhibitory concentration，IC50)，重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-15b組、miR-NC組和對照組的細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，以300 μL上樣緩沖液懸浮細(xì)胞并添加5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶后15 min避光孵育檢測細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.7免疫印跡法檢測 按照總蛋白提取試劑盒說明書提取miR-15b組、miR-NC組和對照組K562/A02細(xì)胞總蛋白并將變性后的蛋白樣品電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后，以ABCC5和β-肌動蛋白一抗(1∶1 000)和二抗(1∶2 000)室溫孵育后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析K562/A02細(xì)胞中ABCC5蛋白表達(dá)情況，重復(fù)3次。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 將包含miR-15b和ABCC5結(jié)合位點(diǎn)的序列片段克隆重組至pmirGLO熒光素酶報告基因載體上，作為野生型ABCC5(ABCC5-WT)載體質(zhì)粒；另外，將miR-15b和ABCC5結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變后克隆重組至pmirGLO載體上，作為突變型ABCC5(ABCC5-MUT)載體質(zhì)粒，將構(gòu)建的ABCC5-MUT和ABCC5-WT載體質(zhì)粒分別與miR-15b模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至K562/A02細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書檢測K562/A02細(xì)胞熒光素酶活性，重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1miR-15b在K562/A02細(xì)胞中的表達(dá) 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示，K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞中miR-15b的相對表達(dá)量分別為(0.97±0.05)和(0.25±0.03)，與K562細(xì)胞比較，K562/A02細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平明顯降低(t=37.044，P<0.001)。

2.2miR-15b對K562/A02細(xì)胞增殖的影響 各組miR-15b表達(dá)水平和不同時點(diǎn)間細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，miR-15b組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平及24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對照組和miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平以及24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平和細(xì)胞增殖抑制率比較

2.3miR-15b對K562/A02細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組、miR-NC組、miR-15b組K562/A02細(xì)胞凋亡率分別為(13.64±2.12)%、(11.58±1.48)%、(23.05±2.85)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.182,P<0.001)。miR-15b組K562/A02細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組和miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Annexin V-FITC：膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素；PI：碘化丙啶；1a：對照組；1b：miR-NC組；1c：miR-15b組

2.4miR-15b對K562/A02細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響 各組不同劑量阿霉素作用下細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，miR-15b組K562/A02細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對照組及miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。對照組、miR-NC組、miR-15b組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值分別為[(5.07±0.50) mg/mL]、[(5.22±0.48) mg/mL]、[(1.81±0.26) mg/mL]，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.980,P<0.001)，miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-15b組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值明顯低于對照組及miR-NC組(P<0.05)，其相對于對照組和miR-NC組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.70倍和2.88倍。

表3 各組不同劑量阿霉素作用下K562/A02細(xì)胞增殖抑制率比較

2.5miR-15b可靶向結(jié)合ABCC5 通過生物信息學(xué)軟件microRNA.org和miRcode預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ABCC5可能是miR-15b的潛在靶基因。各組細(xì)胞熒光素酶活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),miR-15b+ABCC5-WT組細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miR-NC+ABCC5-WT組(P<0.05)；miR-NC+ABCC5-WT組與miR-NC+ABCC5-MUT組和miR-15b+ABCC5-MUT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且miR-NC+ABCC5-MUT組與miR-15b+ABCC5-MUT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

miR：微RNA；ABCC5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C5

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較

2.6miR-15b對K562/A02細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)的影響 各組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，miR-NC組與對照組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-15b組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于對照組和miR-NC組(P<0.05)。見圖3和表5。

miR：微RNA；ABCC5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C5

表5 各組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

白血病作為一類血液癌癥，由于白血病細(xì)胞的過度增殖導(dǎo)致正常造血細(xì)胞功能及排出異常，進(jìn)一步導(dǎo)致血小板減少、免疫缺陷等癥狀，嚴(yán)重威脅患者的生命健康安全。由于治療耐藥性的產(chǎn)生影響患者的治愈率，深入研究白血病耐藥形成的機(jī)制并尋找有效逆轉(zhuǎn)耐藥靶點(diǎn)的方法具有重要意義[10-11]。miRNA是一類長約22個核苷酸且不具有編碼功能的內(nèi)源性短鏈RNA，通過與靶基因mRNA互補(bǔ)配對結(jié)合使mRNA降解或翻譯受阻，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與白血病等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,12-14]。鄧益民等[2]報道指出，miR-125b在阿霉素耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而其表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。miR-15b是miRNA的一員，定位于3q25.33染色體上，有研究指出，miR-15b在口腔鱗癌組織中表達(dá)顯著降低，其表達(dá)上調(diào)有抑癌作用[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b可通過靶向調(diào)控三重基序蛋白14抑制口腔鱗癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，miR-15b在白血病阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/A02中呈低表達(dá)，提示miR-15b可能在白血病阿霉素耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用；miR-15b過表達(dá)后，K562/A02細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率均顯著升高，表明miR-15b具有抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，提示miR-15b在白血病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用；以不同濃度阿霉素處理后，miR-15b過表達(dá)可提高K562/A02細(xì)胞對阿霉素的敏感性，提示miR-15b有逆轉(zhuǎn)白血病阿霉素耐藥的潛能。上述結(jié)果表明，miR-15b過表達(dá)可抑制K562/A02細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及阿霉素敏感性，miR-15b有作為白血病耐藥性治療靶點(diǎn)的潛能。

ABCC5又稱多藥耐藥相關(guān)蛋白5，是體內(nèi)廣泛分布的ABCC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員，在外源性藥物從細(xì)胞向外轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤耐藥密切相關(guān)[17]。楊尚霖等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5與人肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性相關(guān)，沉默其表達(dá)不僅可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，還可以增強(qiáng)細(xì)胞對阿霉素、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物的敏感性。Dharmapuri等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5與白血病伊馬替尼耐藥有關(guān)，而抑制ABCC5表達(dá)是塞來昔布增強(qiáng)白血病細(xì)胞對伊馬替尼敏感的重要機(jī)制；陳霽暉等[20]指出，ABCC5與白血病阿霉素耐藥密切相關(guān)，其在阿霉素耐藥白血病K562細(xì)胞中呈高表達(dá)。本研究雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-15b可與ABCC5靶向結(jié)合；上調(diào)miR-15b表達(dá)后ABCC5 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明ABCC5是miR-15b的靶基因，miR-15b可負(fù)向調(diào)控ABCC5的表達(dá)，且miR-15b可能通過靶向調(diào)控ABCC5抑制K562/A02細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡并逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞對阿霉素耐藥，為白血病化療耐藥性作用機(jī)制的研究及新的耐藥靶點(diǎn)研究提供了參考依據(jù)。但本研究僅從細(xì)胞水平上初步闡述了miR-15b與白血病阿霉素耐藥的關(guān)系，后期將從體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-15b可抑制K562/A02增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞對阿霉素耐藥性，其作用機(jī)制可能與靶向抑制ABCC5有關(guān)。