張 維，彭 友，滕堯樹(shù)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院·浙江 杭州 310006)

甲狀腺癌為常見(jiàn)內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，可出現(xiàn)壓迫食管、氣管等癥狀[1]。目前，臨床以手術(shù)治療為主，藥物及局部放療配合術(shù)后治療，療效雖佳，但仍存在較高的復(fù)發(fā)率。大黃素是大黃、虎杖等傳統(tǒng)中藥的有效成分，屬蒽醌類(lèi)物質(zhì)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，大黃素對(duì)口腔癌、乳腺癌等諸多癌細(xì)胞均具有抑制作用，其通過(guò)抑制細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)其凋亡等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[2-4]。阿帕替尼為抗血管生成制劑，對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)結(jié)合具有高度選擇性，能抑制VEGFR-2表達(dá)，阻斷信號(hào)傳遞，抑制腫瘤血管新生，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。目前關(guān)于大黃素聯(lián)合阿帕替尼對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞K1作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)單一、聯(lián)合給藥作用于體內(nèi)、外K1細(xì)胞，觀察大黃素對(duì)其腫瘤生物學(xué)行為包括遷移、侵襲等的影響，同時(shí)深入分析大黃素結(jié)合阿帕替尼對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的作用效果，進(jìn)一步明確大黃素在甲狀腺癌治療中的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人甲狀腺癌細(xì)胞K1：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。6周齡SPF級(jí)BALB/C裸鼠，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0015，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 甲磺酸阿帕替尼片：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：每片0.25 g。大黃素：國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)。

1.3 試劑和儀器 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒：南京凱基生物發(fā)展有限公司；基質(zhì)膠：美國(guó)BD公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒、VEGFR-2抗體：美國(guó)Abcam公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體：美國(guó)Proteintech Group公司；GAPDH一抗：成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。BD AccuriTMC6流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司；450型酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-RAD公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人甲狀腺癌細(xì)胞K1培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。3 d傳代1次，適時(shí)換液。

2.2 CCK-8法檢測(cè)人甲狀腺癌細(xì)胞K1細(xì)胞活性 96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞進(jìn)行分組：空白組(PBS)、大黃素組(100 μmol/L)、阿帕替尼組(10 μmol/L阿帕替尼)、聯(lián)合組(100 μmol/L大黃素+10 μmol/L阿帕替尼)。設(shè)置復(fù)孔6個(gè)，給藥處理24、48、72 h后，加10 μL CCK-8，再培養(yǎng)4 h，490 nm波長(zhǎng)下采用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 6孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，按2.2進(jìn)行分組，同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。給藥培養(yǎng)48 h，400 μL細(xì)胞懸液，加5 μL Annexin-V FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻后4 ℃避光孵育30 min，測(cè)定K1細(xì)胞凋亡情況。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 6孔板接種K1細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)85%～90%后，用移液槍槍頭垂直劃痕，PBS棄去劃下細(xì)胞。按上述分組給藥，24 h后顯微鏡隨機(jī)取樣拍照，觀察劃痕并計(jì)算劃痕面積?；|(zhì)膠由無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液3:1稀釋?zhuān)?0 μL稀釋液均勻包被Transwell小室，4 ℃孵育過(guò)夜；置于24孔培養(yǎng)板，上室加細(xì)胞懸液5×104個(gè)/200 μL，下室加含F(xiàn)BS培養(yǎng)液500 μL。培養(yǎng)48 h，上層未遷移細(xì)胞輕擦，隨機(jī)選取顯微鏡下視野，計(jì)算侵襲至下室中的細(xì)胞數(shù)量。

2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3及VEGFR-2蛋白表達(dá) 裂解液提取給藥處理細(xì)胞后總蛋白。BCA法蛋白定量，20 μg樣品上樣，設(shè)平行孔3個(gè)，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗，室溫孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。掃描成像，條帶進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2.6 人甲狀腺癌細(xì)胞K1裸鼠皮下移植瘤抑制實(shí)驗(yàn) 48只裸鼠分為模型組、大黃素組、阿帕替尼組、聯(lián)合組，各12只。1×107個(gè)人甲狀腺癌細(xì)胞K1注射于裸鼠左上肢內(nèi)側(cè)，建立甲狀腺癌裸鼠模型。建模后，模型組自由飼養(yǎng)，大黃素組每日2次腹腔注射10 mg/kg大黃素，阿帕替尼組每日2次灌胃給藥100 mg/kg阿帕替尼溶液，聯(lián)合組每日2次給予100 mg/kg阿帕替尼+10 mg/kg大黃素，28 d后，處死裸鼠，收集瘤體進(jìn)行稱重并拍照，計(jì)算腫瘤抑制率。抑制率(%)=[(模型組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量]×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA法)、兩兩比較法(SNK法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞增殖能力的影響 與空白組相比，給藥組細(xì)胞OD值在給藥24、48、72 h后均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中聯(lián)合組OD值下降最顯著。見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01圖1 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞增殖能力的影響

3.2 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響 見(jiàn)圖2～圖3?？瞻捉M給藥24 h后遷移率和侵襲的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(42.03±4.26)%、(41.00±4.36) 個(gè)；而大黃素組、阿帕替尼組、聯(lián)合組遷移率分別為(32.93±3.33)%、(25.32±2.54)%、(17.97±1.80)%較空白組顯著降低，侵襲的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(31.33±3.21) 個(gè)、(28.33±3.06) 個(gè)、(14.67±1.53)個(gè)，較空白組顯著減少；聯(lián)合組的遷移率降低、侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)減少更為明顯，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

圖2 各組K1細(xì)胞遷移能力測(cè)定結(jié)果

圖3 各組K1細(xì)胞侵襲能力測(cè)定結(jié)果

3.3 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)圖4?？瞻捉M凋亡率為(8.39±2.68)%，大黃素組、阿帕替尼組、聯(lián)合組凋亡率分別為(13.93±1.94)%、(16.04±1.50)%、(23.16±0.96)%，均較空白組顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

圖4 各組K1細(xì)胞凋亡的測(cè)定結(jié)果

3.4 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及VEGFR-2蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5。與空白組比較，大黃素組、阿帕替尼組和聯(lián)合組能夠顯著上調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P<0.05)，阿帕替尼組、聯(lián)合組可顯著下調(diào)Bcl-2、VEGFR-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。大黃素組對(duì)Bcl-2、VEGFR-2蛋白表有一定下調(diào)作用，對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)有一定的上調(diào)作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.5 大黃素及聯(lián)合阿帕替尼對(duì)甲狀腺癌K1細(xì)胞移植瘤的抑制作用 見(jiàn)表1。與模型組比較，大黃素組、阿帕替尼組合聯(lián)合組瘤體生長(zhǎng)均能明顯受到抑制，其中聯(lián)合組的對(duì)瘤體的抑制更顯著。

表1 各組K1細(xì)胞移植瘤抑制作用比較

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01圖5 各組K1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及VEGFR-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

4 討論

甲狀腺癌較為常見(jiàn)，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，與鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體、雌激素等有關(guān)，現(xiàn)有治療方法難以降低其復(fù)發(fā)率。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，靶向治療在抗腫瘤治療中占重要地位。阿帕替尼作為臨床廣譜抗腫瘤藥，可通過(guò)靶向結(jié)合ATP位點(diǎn)，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)酪氨酸激酶活性，血管生成受到阻礙，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡具有抑制效果，且臨床已證實(shí)其顯著的抗腫瘤治療作用[6-7]。

本文體外CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示大黃素、阿帕替尼對(duì)K1細(xì)胞均可顯著抑制其增殖活性，且聯(lián)合用藥后抑制作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞抑制率呈時(shí)間依賴性升高。本研究還顯示大黃素與阿帕替尼的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均可誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞K1凋亡，二者聯(lián)合用藥可加強(qiáng)作用效果。劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素和阿帕替尼對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力均有較好的抑制作用，聯(lián)合用藥后尤為明顯。本研究建立的人甲狀腺癌細(xì)胞K1裸鼠皮下移植瘤模型的給藥分組中，大黃素組和阿帕替尼組對(duì)瘤體能有效的抑制其生長(zhǎng)，聯(lián)合組對(duì)瘤體的抑制作用尤為明顯。提示大黃素對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞K1的遷移和生長(zhǎng)能力具有一定的抑制性；對(duì)阿帕替尼用藥效果有一定促進(jìn)作用。

抑制腫瘤細(xì)胞活性同時(shí)調(diào)控腫瘤細(xì)胞主動(dòng)性死亡行為即凋亡對(duì)于腫瘤的治療是一種有效方式。低分化甲狀腺癌存在核扭曲和壞死臨床病理特征，細(xì)胞凋亡參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展[8]，腫瘤細(xì)胞對(duì)正常組織造成侵潤(rùn)，細(xì)胞凋亡也是其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制[9]。Bax是人體主要的促凋亡蛋白，屬于Bcl-2蛋白家族成員，由Bax、Bcl-2結(jié)合的異二聚體，可通過(guò)傳遞凋亡信號(hào)實(shí)現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。Bcl-2為抗凋亡蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。二者比值可決定調(diào)控細(xì)胞凋亡的方向[11]。本研究中大黃素和阿帕替尼均能上調(diào)人甲狀腺癌細(xì)胞K1的Bax蛋白表達(dá)，且二者聯(lián)合用藥后效果更明顯。大黃素和阿帕替尼聯(lián)合用藥后顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，表明大黃素聯(lián)合阿帕替尼具有促進(jìn)人甲狀腺癌細(xì)胞K1凋亡并抑制其生長(zhǎng)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡程序的下游控制因子，Caspase-3的表達(dá)水平是細(xì)胞凋亡的決定因素[12]。本研究顯示大黃素和阿帕替尼聯(lián)合用藥能夠顯著促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)，提示大黃素對(duì)阿帕替尼具有促進(jìn)人甲狀腺癌細(xì)胞K1凋亡作用。

VEGFR-2表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要作用，結(jié)合多種VEGF，介導(dǎo)血管發(fā)育、誘導(dǎo)腫瘤新血管生成，且研究證實(shí)，腫瘤的惡性增殖、遷移均與新生血管息息相關(guān)，是腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源[13]。VEGFR-2的表達(dá)水平也能夠體現(xiàn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。以VEGFR-2為藥物作用靶點(diǎn)也是抗腫瘤的研究熱點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，人甲狀腺癌細(xì)胞K1中存在VEGFR-2的表達(dá)。大黃素和阿帕替尼聯(lián)合用藥能夠很好抑制VEGFR-2的表達(dá)，說(shuō)明大黃素與阿帕替尼同時(shí)用藥能夠進(jìn)一步抑制新生血管進(jìn)而抑制人甲狀腺癌細(xì)胞K1生長(zhǎng)。

本研究初步探討大黃素和阿帕替尼對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞K1生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大黃素單獨(dú)用藥對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞K1的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，大黃素與阿帕替尼聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥的抑制作用更明顯，提示二者存在藥物協(xié)同作用，為甲狀腺癌臨床治療提供了一個(gè)潛在有效的給藥方案，有一定臨床參考價(jià)值。