呂一舟，范云鵬*，張艷玲，馬 霞,*，郭振環(huán)，劉永錄，張國(guó)祖

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 450046；3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464)

鴨病毒性肝炎多發(fā)于雛鴨，是由鴨肝炎病毒感染引起的，發(fā)病后肝臟損傷嚴(yán)重并且病死率極高，在沒(méi)有特效抗病毒藥物治療下嚴(yán)重影響鴨場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益[1]。為了促進(jìn)鴨養(yǎng)殖場(chǎng)穩(wěn)定發(fā)展，減少鴨場(chǎng)病毒性肝炎疾病的發(fā)生，從中獸醫(yī)學(xué)角度辨證，該病屬于濕熱之毒內(nèi)侵導(dǎo)致肝脾不調(diào)、下注于腎，選方應(yīng)以清熱解毒，疏肝利膽為原則[2]。有研究表明，茵陳蒿湯具有抗肝損傷、防治脂肪肝、抗肝纖維化等作用[3-5]，臨床常用于急性病毒性肝炎[6]、黃疸性肝炎和肝內(nèi)膽汁淤積[7-10]等證屬濕熱內(nèi)蘊(yùn)者，在肝病治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)結(jié)合水禽生理特點(diǎn)，在茵陳蒿湯基礎(chǔ)上進(jìn)行加味，即茵陳120 g，梔子60 g，大黃45 g，甘草25 g。為了確定科學(xué)合理的制備工藝條件，本試驗(yàn)進(jìn)行了水提、醇提、水提醇沉3種提取工藝，以浸膏得率和梔子苷含量為指標(biāo)，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)、考慮成本等確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 茵陳、梔子、大黃、甘草，鄭州瑞龍制藥股份有限公司產(chǎn)品；梔子苷對(duì)照品，成都曼斯特生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；純凈水，娃哈哈股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(SYU-3-100D)，鄭州生元儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平(BSA224S)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(SZCL-2)，鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水真空泵(SHZ-D)，鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/10)，鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5299)，鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水提制備工藝研究

1.2.1.1 吸水率考察 稱(chēng)取茵陳30 g、梔子15 g、大黃11.25 g、甘草6.25 g，重復(fù)3份。加10倍量水浸泡，直至藥材全部浸透為止，濾出未被吸收的水液，稱(chēng)量吸水后藥材的重量，計(jì)算吸水率[11]。

1.2.1.2 水提工藝的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 稱(chēng)取茵陳30 g、梔子15 g、大黃11.25 g、甘草6.25 g，共9份，按照表1中三因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行煎煮，過(guò)濾，合并濾液后，常壓濃縮至最小體積，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)干燥至恒重，制得浸膏，并計(jì)算浸膏得率(公式下同)。

浸膏得率

1.2.2 醇提工藝的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 稱(chēng)取茵陳20 g、梔子10 g、大黃7.5 g、甘草4.17 g，共9份，粗粉碎后按照表2中四因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行加熱回流，過(guò)濾，合并濾液后，減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)干燥至恒重，制得浸膏，并計(jì)算浸膏得率。

表2 醇提工藝的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

1.2.3 水提醇沉工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.3.1醇沉終濃度篩選 取1.2.1中最佳條件的加味茵陳蒿口服液水提液4份進(jìn)行醇沉，邊加邊攪拌，至乙醇濃度為800、750、700、600 mL/L，置4℃冰箱過(guò)夜，48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)干燥至恒重，制得浸膏，并計(jì)算浸膏得率。

1.2.3.2 醇沉?xí)r間的考察 取1.2.1中最佳條件的加味茵陳蒿口服液水提液4份進(jìn)行醇沉，邊加邊攪拌，至乙醇濃度為750 mL/L，放置4℃冰箱過(guò)夜，12、24、36、48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)干燥至恒重，制得浸膏，并計(jì)算浸膏得率。

1.2.4 加味茵陳蒿口服液中梔子苷含量測(cè)定

1.2.4.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-1 mL/L磷酸水 (15∶85)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為 238 nm，流速為1 mL/min，對(duì)照品和供試品進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4.2 梔子苷對(duì)照品配制 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，濾膜過(guò)濾即得。

1.2.4.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液配制 精密稱(chēng)取上述水提、醇提、水提醇沉工藝制備的浸膏各0.040 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超聲30 min，放冷，定容后搖勻，用有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得。另取缺梔子的陰性對(duì)照浸膏同法制成陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1 水提制備工藝研究

2.1.1 吸水率考察 由表3數(shù)據(jù)分析可知，稱(chēng)取加味茵陳蒿口服液處方藥的1/4重量加水浸泡后，其吸水率為187%～200%，約為2倍吸水量。

表3 水提工藝的吸水率考察

2.1.2 梔子苷專(zhuān)屬性考察 由圖1可看出，梔子苷專(zhuān)屬性好，陰性樣品無(wú)干擾。

A.梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品；B.供試品處理；C.陰性對(duì)照處理A.Geniposide standard；B.Testing sample；C.Negative control

2.1.3 水提工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果 由表4極差分析結(jié)果可知，水提工藝各因素水平對(duì)浸膏得率影響依次是C>A>B，即煎煮次數(shù)>料液比>提取時(shí)間，浸膏得率最佳的工藝為A3B1C3。影響梔子苷含量因素水平順序?yàn)镃>B>A，即煎煮次數(shù)>提取時(shí)間>料液比，提取梔子苷含量最高的工藝為A1B3C3，其次是A3B1C3。

表4 水提工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

通過(guò)表5方差分析得出，提取次數(shù)對(duì)浸膏得率和梔子苷含量存在極顯著性差異(P<0.01)，其他因素影響小?？紤]到生產(chǎn)中水分揮發(fā)快，故確定料液比為1∶12；經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得出提取時(shí)間對(duì)浸膏得率和梔子苷含量影響小，從縮短生產(chǎn)周期和提高經(jīng)濟(jì)效益考慮，選取煎煮時(shí)間為1 h；煎煮2次與煎煮3次對(duì)浸膏得率和梔子苷含量的顯著性差異不明顯(P>0.05)，為降低生產(chǎn)成本選擇煎煮次數(shù)為2次。因此確定的最佳水提工藝條件為：A3B1C2，即補(bǔ)足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。

表5 水提工藝試驗(yàn)方差分析

2.2 醇提工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

由表6極差分析顯示，影響醇提工藝浸膏得率的水平順序是D>C>A>B，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇濃度>料液比，浸膏得率最佳組合為A2B1C2D3；影響梔子苷含量因素水平順序?yàn)锳>D>B>C，即乙醇濃度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間，提取梔子苷含量最高為A3B2C1D3。

表6 醇提正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

通過(guò)表7方差分析可看出提取次數(shù)對(duì)浸膏得率影響存在極顯著差異(P<0.01)。由數(shù)據(jù)分析可知，提取2次和提取3次對(duì)浸膏得率差異不顯著(P>0.05)，料液比和提取時(shí)間對(duì)浸膏得率和梔子苷含量影響小，700 mL/L乙醇濃度和800 mL/L乙醇濃度對(duì)梔子苷含量影響差異不顯著(P>0.05)，考慮成本和時(shí)間問(wèn)題，確定醇提最佳工藝為：A2B1C1D2，即加8倍量700 mL/L乙醇，加熱回流2次，每次40 min。

表7 醇提工藝試驗(yàn)方差分析

2.3 水提醇沉工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)最佳水提工藝補(bǔ)足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡半小時(shí)，煎煮2次，每次煎煮1 h。合并兩次濾液濃縮，使藥液濃度為含生藥1 g/mL，放冷后進(jìn)行醇沉工藝單因素試驗(yàn)。由圖2A可看出醇沉終濃度在700 mL/L時(shí)浸膏得率和梔子苷含量最高；圖2B顯示醇沉?xí)r間在48 h時(shí)梔子苷含量和浸膏得率最高，因此確定醇沉最佳工藝為700 mL/L醇沉終濃度，醇沉48 h。

A.醇沉終濃度單因素試驗(yàn)；B.醇沉?xí)r間單因素試驗(yàn)A.Single factor test of final concentration of alcohol precipitation; B.Single factor test of alcohol precipitation time

3 討論

中獸醫(yī)理論認(rèn)為，鴨病毒性肝炎是雛鴨受病毒、濕邪侵?jǐn)_，脾陽(yáng)困而運(yùn)化失，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，導(dǎo)致病鴨食欲廢絕、排稀糞，嚴(yán)重者出現(xiàn)昏迷倒地、角弓反張等癥狀[2]。本方劑以茵陳為主藥，清濕熱，利肝膽；梔子清泄三焦?jié)駸?；大黃蕩滌腸胃淤熱；添加甘草進(jìn)行加味，甘草補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，有調(diào)和諸藥之功效[12-14]。前三藥均味苦性寒，清熱利濕，使?jié)駨亩闩判?，而甘草味甘，性平，可調(diào)和苦寒之性，調(diào)節(jié)口味，制成口服液便于臨床使用。

中藥口服液的制備工藝會(huì)直接影響其有效成分的含量及后期的臨床使用效果，現(xiàn)代制藥工藝的發(fā)展使很多質(zhì)控指標(biāo)得到改進(jìn)[15]。茵陳作為加味茵陳蒿口服液中的君藥，其有效標(biāo)識(shí)成分是綠原酸。在前期摸索試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)去除茵陳的陰性對(duì)照里也檢出綠原酸，且含量不低，這與楊海玲等[16]研究的不同炮制方法對(duì)梔子中綠原酸含量影響相符合，梔子中也含有綠原酸。由于茵陳中的綠原酸在本方劑中不具備專(zhuān)屬性，故選取專(zhuān)屬性好的梔子苷作為衡量指標(biāo)之一。

水提醇沉單因素試驗(yàn)不同濃度及不同醇沉?xí)r間的藥液在回收乙醇至無(wú)醇味補(bǔ)足水量后，4℃放置24 h后都出現(xiàn)了沉淀，且搖之不易散，放置室溫和加熱至40℃以上也不消散，由此可看出加味茵陳蒿口服液水提醇沉工藝不穩(wěn)定，故排除此種工藝在生產(chǎn)中的應(yīng)用。 影響加味茵陳蒿口服液水提工藝和醇提工藝的首要因素為煎煮(提取)次數(shù)，水提工藝中煎煮2次的浸膏得率范圍在12.3%～18.3%，梔子苷含量在10.51 mg/g～13.96 mg/g之間。醇提工藝中提取2次的浸膏得率范圍在12.7%～14.5%，梔子苷含量在10.74 mg/g～25.88 mg/g之間。從經(jīng)濟(jì)成本考慮，按照水提最佳工藝：補(bǔ)足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次的方法提取500 g藥材，所需的用水量為13 L，按照商業(yè)用水價(jià)格計(jì)算約為1元，能耗價(jià)格約為3元，總成本為4元。按照醇提最佳工藝：8倍量700 mL/L乙醇，加熱回流2次，每次40 min的方法提取500 g藥材，所需的無(wú)水乙醇量為5.6 L，水量為2.4 L，價(jià)格約為56.2元，能耗價(jià)格約為5元，總成本在61.2元左右。

結(jié)果可見(jiàn)，水提浸膏得率12.3%～18.3%與醇提浸膏得率12.7%～14.5%差別不大。而醇提時(shí)梔子苷含量雖然最高為25.88 mg/g，但此時(shí)乙醇濃度是800 mL/L，經(jīng)濟(jì)成本換算后，以水提工藝最節(jié)約易行。

通過(guò)以上試驗(yàn)研究并結(jié)合成本、工時(shí)等因素考慮，確定了加味茵陳蒿口服液的最佳制備工藝為水提工藝，即補(bǔ)足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。具有成本低、提取效率高、安全方便、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用。