梅 力，高曉龍，王英超，高 敏，趙啟祖，李 翠，宋彥軍*，馮小宇*

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京大興 102629；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀 100081)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的一種急性、熱性、敗血性、高度接觸性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將ND列為必須報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。疫苗所用毒株為LaSota株[1]，對不同基因型的ND強毒流行株均產(chǎn)生完全的臨床保護[2]。

發(fā)達國家對重要動物疫病控制進行了長期研究，逐漸統(tǒng)一了重大動物疫病預(yù)防疫苗、診斷制劑和試驗技術(shù)的評價方法，建立了相關(guān)的標準物質(zhì)。我國動物病原微生物檢測標準物質(zhì)的研究并不深入，特別是在核酸標準物質(zhì)的研制方面才起步較晚[3]。目前，由于我國各級獸醫(yī)檢測實驗室軟硬件條件相差較大，診斷試劑種類繁多，標準物質(zhì)的缺失導(dǎo)致我國在動物疫病檢測方面缺乏一致性和可比性[4]，制約了我國對動物疫病的有效防控。因此，研制出獸用檢測相關(guān)標準物質(zhì)，不僅可以提高全國不同類型獸醫(yī)檢測實驗室的檢測能力和技術(shù)水平，更為動物疫病凈化和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和實驗動物 新城疫病毒LaSota株，由本實驗室保存；9日齡～11日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；50 g/L蔗糖牛奶凍干保護劑，北京中海生物科技有限公司產(chǎn)品；One-step qPCR supermix ，Takara公司產(chǎn)品；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes，伯樂公司產(chǎn)品；新城疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，世紀元亨公司產(chǎn)品；禽傳染性喉氣管炎熒光PCR檢測試劑盒，北京億森寶生物科技有限公司產(chǎn)品；雞減蛋綜合征病毒(EDSV)核酸檢測試劑盒、雞傳染性法氏囊炎病毒(IBDV)核酸檢測試劑盒，廣州維伯鑫生物科技股份有限公司產(chǎn)品；引物和探針由英濰捷基公司合成。

1.1.3 主要儀器 自動孵化器(LYON RX2)，Lion electric company產(chǎn)品；天隆全自動核酸提取儀(NP968-C)，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；凍干機(EYELA FDU-1200)，東京理化器械株式會社產(chǎn)品；微滴式數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)(QX100Droplet Generator、QX100Droplet Reader、QX100微滴式數(shù)字PCR儀)、CFX96 Touch熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng)及濃度測定 將本實驗室保存的NDV LaSota毒株用PBS稀釋1 000倍后接種9日齡SPF雞胚，37℃孵育，觀察雞胚死亡情況，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，72 h后無菌采集雞胚尿囊液，該尿囊液即為NDV LaSota株的病毒液。將收獲的病毒培養(yǎng)液以4 500 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜進行過濾。將收集的病毒液65℃水浴2 h滅活，并進行滅活檢驗。

1.2.2 病毒的凍干 將病毒液與凍干保護劑1∶1等體積充分混勻，每瓶1 mL分裝于凍干瓶內(nèi)，放入超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍24 h，保證預(yù)凍為固體狀態(tài)，按照EYELA FDU-1200凍干機操作說明進行凍干，凍干結(jié)束后取出凍干瓶，壓好膠塞并加鋁蓋加固密封，最后置于-20℃±2℃環(huán)境中保存。

1.2.3 特性檢驗

1.2.3.1 物理性狀檢驗 NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)應(yīng)呈白色均一粉末。

1.2.3.2 病毒滅活檢驗 將NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)解凍后，接種于9日齡SPF雞胚，連續(xù)觀察3 d后收獲培養(yǎng)物，盲傳至少3代，觀察雞胚死亡情況，判定標物物質(zhì)是否已經(jīng)滅活。

1.2.3.3 支原體檢驗 將NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)解凍后，利用支原體培養(yǎng)方式檢測是否存在支原體污染。

1.2.3.4 其他病毒檢驗 制備NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)過程中，對H9N2亞型禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽傳染性喉氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、禽腺病毒4型和雞傳染性法氏囊病病毒共6種其他病毒進行檢驗，對以上病毒進行檢驗時依據(jù)了國標檢測方法，對沒有標準參考的病毒則使用商品化試劑盒或參考公開發(fā)表文獻方法進行檢驗[5]。

1.2.3.5 凍干標準物質(zhì)的水分檢驗 取NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)5瓶，依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015年版三部附錄《剩余水分測定》，按照其規(guī)程操作，進行水分測定[6]。

1.2.4 均勻性評估 隨機抽取核酸標準物質(zhì)15瓶，每瓶檢測3次，采用數(shù)字PCR方法對NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)的核酸含量進行檢測，通過SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析(F檢驗)進行均勻性檢驗。

1.2.5 穩(wěn)定性評估 本研究采用數(shù)字PCR方法考察了NDV LaSota株核酸檢測標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。

1.2.5.1 短期穩(wěn)定性 標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性與樣品運輸過程中的外部因素有關(guān)。按如下方式進行短期穩(wěn)定性的抽樣評估，將標準物質(zhì)分別置于4℃、25℃、60℃條件下，按指定周期進行檢驗，提取核酸后使用數(shù)字PCR方法進行檢測，每次抽取樣品3瓶，每瓶重復(fù)檢測3次，通過SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行分析，使用配對t檢驗對標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性進行評估。

1.2.5.2 長期穩(wěn)定性 標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性與貯存條件有關(guān)。按如下方式進行長期穩(wěn)定性的抽樣評估，對-20℃±2℃條件下保存的標準物質(zhì)，于第1、2、4、6、8、11個月，隨機抽取3瓶，提取核酸后使用數(shù)字PCR方法進行檢測，每瓶樣品重復(fù)檢測3次，計算均值，對長期穩(wěn)定性進行評估。

1.2.6 開瓶穩(wěn)定性 本研究通過開瓶穩(wěn)定性試驗來考察本標準物質(zhì)開瓶后的穩(wěn)定性。抽取標準物質(zhì)3瓶，分為第1次～第5次開瓶檢測，每瓶每次做3個復(fù)孔，以第1次開瓶的檢測數(shù)據(jù)為對照組，用數(shù)字PCR方法進行檢測，通過SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行分析，使用配對t檢驗方法分析本標準物質(zhì)開瓶后的穩(wěn)定性。

1.2.7 標準物質(zhì)的定值 NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)定值按照JJF1343-2012標準要求，通過多個實驗室協(xié)作定值，本次參加定值的實驗室數(shù)目為8個。8家實驗室均具有一定的技術(shù)權(quán)威性，在使用數(shù)字PCR方法測定標準物質(zhì)特性方面具有必備條件以及同等的技術(shù)能力和經(jīng)驗。

定值方案如下：8家實驗室對核酸標準物質(zhì)各進行8次檢驗得到8組定值數(shù)據(jù)，對組內(nèi)數(shù)據(jù)進行可疑值檢驗、對組間數(shù)據(jù)進行等精度檢驗。在組內(nèi)數(shù)據(jù)無可疑值、組間數(shù)據(jù)等精度的條件下，利用t檢驗方法評價各組數(shù)據(jù)平均值的顯著性，將數(shù)據(jù)合并后利用正態(tài)分布分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性，在符合正態(tài)分布的情況下，可用多個平均值的算數(shù)平均值表示該標準物質(zhì)的標準值。

1.2.8 不確定度的評定 標準物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度由均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度以及標準物質(zhì)定值過程引入的不確定度組成。

1.2.8.1 均勻性引入的不確定度的評定 均勻性引入的相對標準不確定度由標準物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的標準偏差sb和標準物質(zhì)的標準值計算。

1.2.8.2 穩(wěn)定性引入的不確定度的評定 穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度由標準物質(zhì)存儲在-20℃條件下11個月的長期穩(wěn)定性的不確定度來計算。

1.2.8.3 定值過程引入的不確定度的評定 定值過程引入的不確定度的評定包括不確定度的A類評定和不確定度的B類評定。不確定度的A類評定：通過測量數(shù)據(jù)的標準偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計學(xué)計算方法進行。不確定度的B類評定：本標準物質(zhì)的不確定度B類評定包含4部分，第1部分是天平稱量引入的不確定度；第2部分是稀釋引入的不確定度，主要為移液器引入的不確定度；第3部分是檢測儀器引入的不確定度，主要為數(shù)字PCR儀引入的不確定度；第4部分是核酸回收率引入的不確定度。由這4部分不確定度合成最終的B類不不確定度。

將均勻性評估、穩(wěn)定性評估引入的不確定度和定值引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加得到合成標準不確定度，記為UCRM。該合成標準不確定度乘以因子(該因子稱為包含因子，記為k)得出的不確定度稱為擴展不確定度或總不確定度，記為U。

1.2.9 定值結(jié)果的表示 NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)的定值結(jié)果由本標準物質(zhì)的標準值除以核酸回收率后，±擴展不確定度來表示。

1.2.10 臨床試用評價 隨機抽取NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)15瓶，送至3家試用單位(北京中科基因技術(shù)有限公司、北京市昌平區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、北京市大興區(qū)動物疾病控制中心)進行檢測，每家試用單位檢測5瓶。試用單位在檢測日常臨床樣本時，將試用的NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)和臨床樣本同時提取核酸，嚴格按照檢測試劑的說明書將標準物質(zhì)和臨床樣本一同進行熒光定量PCR檢測，每次檢測1瓶標準物質(zhì)，每瓶重復(fù)檢測2次，記錄試驗結(jié)果并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 標準物質(zhì)的制備

將NDV LaSota毒株稀釋后接種9日齡SPF雞胚獲得的雞胚尿囊液即為病毒培養(yǎng)液，將其與凍干保護劑等體積混勻、分裝后放入凍干機進行凍干，即為制備的NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)。該標準物質(zhì)性狀為白色均一粉末；病毒滅活檢驗顯示該標準物質(zhì)不能引起雞胚病變，說明已滅活徹底；支原體培養(yǎng)檢驗顯示無支原體生長；其他病毒檢驗顯示H9N2亞型禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽傳染性喉氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、禽腺病毒4型和雞傳染性法氏囊病病毒6種病毒檢驗均為陰性，如表1；水分檢驗顯示該凍干標準物質(zhì)水分含量小于3.0%，水分含量合格，如表2。

表1 其他病毒檢驗

表2 NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)凍干品水分測定結(jié)果

2.2 均勻性評估結(jié)果

隨機抽取核酸標準物質(zhì)15瓶，每瓶檢測3次，采用數(shù)字PCR方法對標準物質(zhì)的核酸含量進行檢測，通過SPASS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析(F檢驗)對數(shù)據(jù)進行均勻性檢驗，根據(jù)自由度(v1,v2)及給定的顯著性水平α，可由表查臨界值的F值，經(jīng)計算F0.05)，本標準物質(zhì)是均勻的，方差分析結(jié)果如表3。

表3 均勻性分析結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性評估結(jié)果

2.3.1 短期穩(wěn)定性評估結(jié)果 將NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)在4、25、60℃條件下的檢測結(jié)果與存放在-80℃條件下的檢測結(jié)果分別進行t檢驗分析，如表4所示。4℃存放4周的檢測值與對照組標準物質(zhì)的檢測值不存在顯著性差異，可認為本標準物質(zhì)在4℃環(huán)境下可穩(wěn)定4周；25℃存放7 d時P>0.05，即在25℃環(huán)境下存放1周的檢測值與對照組標準物質(zhì)的檢測值不存在顯著性差異，存放14 d時出現(xiàn)顯著性差異，可認為本標準物質(zhì)在25℃環(huán)境下可穩(wěn)定1周；60℃存放7 d的t檢驗結(jié)果與對照組標準物質(zhì)的檢測值存在顯著性差異，可認為本標準物質(zhì)不能置于60℃環(huán)境下。

表4 短期穩(wěn)定性t檢驗結(jié)果

2.3.2 長期穩(wěn)定性評估結(jié)果 對-20℃±2℃條件下保存的標準物質(zhì)，于第1、2、4、6、8、11個月，隨機抽取3瓶進行數(shù)字PCR檢測，每瓶樣品重復(fù)檢測3次，試驗數(shù)據(jù)如表5所示，計算均值，進行穩(wěn)定性分析。

表5 -20℃條件下NDV核酸標準物質(zhì)拷貝數(shù)

根據(jù)數(shù)據(jù)所得：

T(0.95,5)查表得：2.57。

T(0.95,3)*s(β1)=1.48E+03

對NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)在-20℃貯存條件下穩(wěn)定性結(jié)果進行分析，結(jié)果β1小于T(0.95,3)*s(β1)，故認為斜率無顯著差異(P>0.05)，未觀測到不穩(wěn)定性，能滿足實際測量的需要?？烧J為本標準物質(zhì)在-20℃環(huán)境下可穩(wěn)定11個月。

2.3.3 開瓶穩(wěn)定性評估 抽取NDV核酸標準物質(zhì)3管共開瓶5次進行開瓶穩(wěn)定性評估，以第1次開瓶的檢測數(shù)據(jù)為對照組，用數(shù)字PCR方法進行檢測。根據(jù)配對t檢驗的結(jié)果顯示(表6)，第2次、第3次、第4次、第5次的檢測結(jié)果均與第1次的檢測結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，說明本標準物質(zhì)開瓶5次是穩(wěn)定的。

表6 開瓶穩(wěn)定性T檢驗結(jié)果

2.4 標準物質(zhì)的定值結(jié)果

由8家具備同等實驗?zāi)芰蜅l件的實驗室協(xié)助完成本標準物質(zhì)的定值工作。經(jīng)過數(shù)據(jù)檢驗和分析，各組測量數(shù)據(jù)是等精度數(shù)據(jù)，并且組間平均值無顯著性差異，故測量結(jié)果可以用算術(shù)平均值表示，除以核酸回收率92%，最終確定NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)的標準值為1.7E+05 copies/mg。

2.5 不確定度的評定

2.5.1 均勻性引入的不確定度 均勻性引入的相對標準不確定度由標準物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的標準偏差sbb和標準物質(zhì)的標準值計算。此標準物質(zhì)均勻性引入的不確定度為：ubb=sbb=4.3E+03 copies/mg，相對標準不確定度urel(bb)=0.026。

2.5.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度由標準物質(zhì)存儲在-20℃條件下11個月的長期穩(wěn)定性的不確定度來計算。此標準物質(zhì)存儲在-20℃條件下11個月的長期穩(wěn)定性的不確定度為：us=6.34E+03 copies/mg，相對標準不確定度urel(s)=0.039。

2.6 定值結(jié)果的表示

NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)的定值結(jié)果表示為1.7×105copies/mg±0.3×105copies/mg。

2.7 臨床試用評價

試用單位在檢測日常臨床樣本時，將試用的NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)和臨床樣本同時提取核酸，嚴格按照檢測試劑的說明書將標準物質(zhì)和臨床樣本一同進行熒光定量PCR檢測，每次檢測1瓶標準物質(zhì)，每瓶重復(fù)檢測2次，記錄試驗結(jié)果并分析試驗數(shù)據(jù)。

委托3家單位對制備的NDV LaSota株核酸標準物質(zhì)進行了試用性評價，試驗結(jié)果表明本標準物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性良好，量值的準確度高，與臨床樣本互通性好，具備可靠的臨床應(yīng)用價值。

3 討論

目前，在國家標準物質(zhì)資源共享平臺可查詢到的動物病毒核酸標準物質(zhì)主要集中于豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株、美洲變異株和美洲經(jīng)典株，豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒和豬塞內(nèi)卡病毒的核酸標準物質(zhì)，未涉及禽類病毒。

本研究通過提取滅活的新城疫病毒LaSota株全病毒核酸，利用穩(wěn)定的凍干工藝進行凍干，并對其均勻性、穩(wěn)定性開展了嚴格評估，成功制備出了新城疫病毒核酸標準物質(zhì)，經(jīng)專家評定和認可，獲得了國家二級標準物質(zhì)證書。與體外轉(zhuǎn)錄病毒的單個基因序列開展標準品研究相比，能夠更大限度的接近并還原真實病毒的RT-PCR反應(yīng)過程，作為檢測用標準物質(zhì)更具有代表性和可靠性。經(jīng)過進一步的工藝完善和臨床試用，將為實驗室核酸檢測的質(zhì)量控制和疫病防控提供有力保障。

我國的標準物質(zhì)管理辦法規(guī)定標準物質(zhì)的定值結(jié)果一般表示為標準值±總不確定度[1]。本研究中標準物質(zhì)的不確定度由以下幾部分組成，即均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度和標準物質(zhì)的定值過程引入的不確定度，對這3類不確定度開展了明確的評定，保證了標準物質(zhì)的定值結(jié)果符合國家計量技術(shù)規(guī)范的相關(guān)要求[7]。

標準物質(zhì)的制備和定值過程中使用了數(shù)字PCR技術(shù)[8]，數(shù)字PCR的技術(shù)原理是利用數(shù)字PCR系統(tǒng)核心的微滴化技術(shù)，微滴發(fā)生器將每個樣品分成20 000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有1個至數(shù)個待檢核酸靶分子，每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器。擴增完畢后采用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR具有更好的精確度和靈敏度，已被廣泛地應(yīng)用于疾病檢測、轉(zhuǎn)基因成分檢測、食品安全等領(lǐng)域[9-11]。如今在標準物質(zhì)的制備和定值過程中，數(shù)字PCR技術(shù)也在逐漸取代熒光定量方法，從而充分保證了制備的標準物質(zhì)的準確性和技術(shù)權(quán)威性[12]。