刀筱芳，楊有文，傅 雪，楊發(fā)龍

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

乳房炎是威脅山羊養(yǎng)殖最為常見的疾病之一，特別是隨著養(yǎng)殖方式從傳統(tǒng)的放養(yǎng)向規(guī)模化養(yǎng)殖的轉(zhuǎn)變，其發(fā)病率提高，危害更為突出。

多種病原微生物與羊乳房炎的發(fā)生相關(guān)，其中主要以大腸埃希氏菌、葡萄球菌和鏈球菌為主，占乳房炎致病菌總數(shù)的80%～90%[1-2]，并具有經(jīng)濟(jì)和流行病學(xué)上的重要性?？焖俸蜏?zhǔn)確的病原鑒定對(duì)于乳房炎的診斷和合理治療至關(guān)重要[3]。由于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定過程費(fèi)時(shí)耗力，無法作為常規(guī)手段用于山羊乳房炎的診斷。因此，PCR等分子生物學(xué)技術(shù)已成為診斷乳房炎的重要手段。采用PCR進(jìn)行特異和敏感檢測(cè)的前提條件是要從樣本中制備良好的病原DNA。然而，由于不同的樣本其成分存在很大差異，且常存在一些影響DNA提取效率的物質(zhì)及抑制PCR擴(kuò)增的因子，從而導(dǎo)致其敏感性下降[4]。因此，在利用PCR等分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)山羊乳房炎進(jìn)行診斷和病原檢測(cè)時(shí)，極有必要對(duì)羊乳中相關(guān)病原DNA的提取方法進(jìn)行篩選和優(yōu)化[5-7]。

本研究對(duì)3種方法提取山羊乳中致乳房炎病原菌基因組DNA的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，特別是對(duì)后續(xù)PCR檢測(cè)的影響進(jìn)行了比較，以期為今后利用PCR等分子檢測(cè)手段對(duì)羊乳房炎病原的檢測(cè)提供方法學(xué)上的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及健康山羊乳 金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸埃希氏菌為西南民族大學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；健康山羊乳采集自無隱性及臨床乳房炎的母羊，經(jīng)細(xì)菌分離和鑒定為上述病原菌陰性。

1.1.2 主要試劑 TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；CTAB抽提液、蛋白酶K、飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、SDS、EDTA，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；PremixTaq、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀(ETC 811)，蘇州東勝興業(yè)科技儀器有限公司產(chǎn)品；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop One)，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Doc 2000)、熒光定量PCR儀(CFX96)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；超純水儀(Milli-Q)，法國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)(5417R、5804R)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(JY300C)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 含不同濃度細(xì)菌的羊乳樣本制備 在健康山羊乳中分別加入不同濃度的3種病原菌，從而模擬含有不同菌體濃度的患乳房炎山羊的羊乳。分別取0.02 mL不同濃度的無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌菌液，共同加至0.94 mL羊乳中，最終制備成每1 mL健康山羊乳中含有1×106CFU～100CFU致病菌的羊乳樣本。另將0.06 mL生理鹽水加入0.94 mL健康山羊乳中，作為陰性對(duì)照。

1.2.2 總DNA提取 分別采用TIANamp Bacteria DNA Kit、酚/氯仿法和CTAB/NaCl法，從上述含不同濃度細(xì)菌的羊乳樣本中提取總DNA，各方法主要過程如下。

酚/氯仿法[8]：取1 mL羊乳，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入500 μL STE、20 μL 100 g/L SDS、20 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混勻后置于56℃水浴消化3 h。加入500 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后10 000 r/min離心4 min。吸上清，加入500 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，10 000 r/min離心3 min后取上清液，加入30 μL 5 mol/L的NaCl，1 000 μL預(yù)冷無水乙醇，混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀中加入500 μL 700 mL/L 乙醇，10 000 r/min離心2 min，棄乙醇，晾干后向沉淀中加入100 μL TE溶解，置-20℃保存。

CTAB/NaCl法[9]：取1 mL羊乳，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中先后加入75 μL TE、5 μL 100 g/L SDS，38 μL 5 mol/L NaCl 溶液、38 μL CTAB 緩沖液，于65℃溫育20 min；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻，于10 000 r/min 離心5 min；加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，然后與上清液混勻，10 000 r/min 離心5 min；將上清液移至新管中，加入0.6倍體積異丙醇混合靜置10 min后，于10 000 r/min離心5 min；棄上清液，加700 mL/L 乙醇洗滌，于12 000 r/min 離心2 min，棄上清液，取 100 μL的TE溶解，置-20℃保存。

TIANamp Bacteria DNA Kit提取羊乳中細(xì)菌DNA按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.3 不同方法提取DNA的濃度及純度評(píng)價(jià) 為了比較上述3種方法從羊乳中提取的總DNA的濃度和純度，分別采用3種方法從1 mL含有106CFU各致病菌的羊乳中提取總DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取的DNA OD 260/OD 280值和濃度。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成 按文獻(xiàn)[10]報(bào)道，合成檢測(cè)3種病原菌的特異性引物，引物序列見表1，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 不同方法提取致病菌DNA的PCR擴(kuò)增 為評(píng)價(jià)3種方法提取DNA的效果以及最終對(duì)各病原進(jìn)行PCR檢測(cè)的影響，以上述用不同方法提取的、含有不同濃度細(xì)菌的羊乳DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5min；94℃ 30 s、退火(金黃色葡萄球菌為64℃；無乳鏈球菌60℃；大腸埃希氏菌為53℃) 30 s、72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min，結(jié)束反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：去離子水6 μL，PremixTaq10 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 不同方法的提取時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本比較 根據(jù)不同方法所使用試劑及操作過程，對(duì)各方法提取含不同濃度細(xì)菌羊乳DNA所需的時(shí)間和成本進(jìn)行概算和比較。

2 結(jié)果

2.1 不同方法提取的DNA濃度、純度及完整性

結(jié)果如表2。 采用試劑盒、酚/氯仿法及CTAB/NaCl法，從每mL含有106CFU各致病菌的羊乳中提取總DNA，通過核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度及OD 260nm/OD 280nm值。

從表2可知，TIANamp Bacteria DNA Kit以及酚氯仿法提取的DNA其OD 260/OD 280 <1.6，表明提取的DNA中有酚類或蛋白殘留；從獲取的DNA濃度來看，酚/氯仿法提取的DNA濃度最高，其次為CTAB/NaCl法，而試劑盒所得DNA濃度最低。

表2 不同方法提取總DNA的純度和濃度

2.2 不同提取方法對(duì)乳房炎主要病原菌PCR檢測(cè)的影響

將不同濃度的無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別加入到山羊乳中，并采用3種方法分別提取DNA作為模板，用3種病原的特異性PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1。

可見，針對(duì)兩種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌)，采用商品化試劑盒和CTAB/NaCl法提取DNA后，能從每mL含有100 CFU細(xì)菌的樣本中檢測(cè)到目標(biāo)片段，采用酚/氯仿法提取的DNA僅能從每mL含有104CFU菌體的樣本檢測(cè)到。對(duì)于大腸埃希氏菌，3種方法提取DNA的效果相同，能成功從每mL含有103CFU菌體的樣本檢測(cè)到。上述試驗(yàn)經(jīng)3次重復(fù)，結(jié)果一致。

A.金黃色葡萄球菌;B.無乳鏈球菌;C.大腸埃希氏菌;Ma.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；Mb.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; N.無模板對(duì)照；1～7.病原濃度分別為1.0×106、1.0×105、1.0×104,、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 CFU

2.3 成本及時(shí)間效率概算

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)各方法提取DNA的時(shí)間效率以及經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)各方法提取一個(gè)樣本所需時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行概算，結(jié)果見表3。從所需時(shí)間上看，試劑盒法所需時(shí)間最短，而酚/氯仿法所需時(shí)間最長(zhǎng)，近3 h。從經(jīng)濟(jì)成本估算，試劑盒法成本最高，CTAB/NaCl法和酚/氯仿法成本相當(dāng)，為每個(gè)樣本1元～1.5元。

表3 不同提取方法所需時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本概算

3 討論

細(xì)菌感染是引起牛、羊乳房炎的重要因素。傳統(tǒng)上需要通過細(xì)菌分離、培養(yǎng)及后續(xù)的染色形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)等方法來進(jìn)行病原的鑒定，其耗時(shí)費(fèi)力，且多種原因可造成分離率低。有報(bào)道顯示，從患有臨床乳腺炎的乳房采集的奶樣中，有部分樣本(20%～30%)的細(xì)菌培養(yǎng)是陰性的[11]。

PCR等分子檢測(cè)技術(shù)已成為牛、羊乳房炎診斷和病原檢測(cè)的有效手段。除傳統(tǒng)的PCR之外，針對(duì)引起乳房炎的相關(guān)病原，已相繼建立的有熒光定量PCR[11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[12]和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)[13]等方法。然而，乳樣中病原DNA的提取效果會(huì)嚴(yán)重影響PCR的檢測(cè)效果，因此有研究對(duì)不同方法從牛乳中提取乳房炎相關(guān)病原的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)和篩選[14]，但目前尚無針對(duì)山羊乳中乳房炎病原菌DNA提取方法進(jìn)行篩選的報(bào)道。

本研究針對(duì)引起羊乳房炎的常見病原，即2種革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌)和1種革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸埃希氏菌)，對(duì)3種常用且可行的DNA提取方法進(jìn)行了比較。其中，酚/氯仿法作為經(jīng)典的DNA提取方法，主要是利用十二烷基磺酸鈉、蛋白酶 K、飽和苯酚和氯仿等成分有效地裂解細(xì)胞膜、去除蛋白質(zhì)從而獲得DNA。本研究結(jié)果表明，采用酚/氯仿法從羊乳中提取總DNA，其得率(濃度)遠(yuǎn)高于其他方法，而且蛋白及RNA污染較少，但采用該方法提取3種病原DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，敏感性均低于其他兩種方法，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌2種革蘭氏陽性細(xì)菌，其原因可能是該方法提取的DNA有酚類殘留，影響PCR擴(kuò)增。

基于硅膠膜的試劑盒法提取基因組 DNA 有諸多優(yōu)點(diǎn)，如方便、快速并且可降低有機(jī)試劑對(duì)操作人員的傷害等。本研究采用硅膠膜試劑盒提取山羊乳中3種病原的DNA，提取的DNA濃度雖然較低，但采用PCR擴(kuò)增時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌檢測(cè)敏感性比酚/氯仿法均高100倍，表明其是乳房炎病原DNA提取的理想方法。其唯一不足是成本較高，在生產(chǎn)實(shí)際中，若需要檢測(cè)大批量樣本，需考慮經(jīng)濟(jì)成本問題。

CTAB/NaCl法是利用陽離子去污劑溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物可溶于高鹽溶液，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。本研究采用CTAB/NaCl法所獲得的DNA濃度較高，無明顯的蛋白和RNA污染，所需時(shí)間大大短于常用的酚/氯仿法且成本很低。最為重要的是用該方法提取山羊乳中相關(guān)病原的DNA作為模板，PCR檢測(cè)敏感性與試劑盒法相同。其不足是提取DNA前仍需準(zhǔn)備相關(guān)試劑，沒有商品化試劑盒方便。

總之，本研究比較了3種方法對(duì)羊乳中致乳房炎的主要3種病原菌DNA的提取及PCR檢測(cè)的影響?？傮w評(píng)價(jià)表明，CTAB/NaCl法具有成本低、時(shí)間較短且操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)；基于硅膠膜的商品化試劑盒有成套試劑，具有安全、方便和快速的優(yōu)點(diǎn)，但成本較高；而常規(guī)的酚/氯仿法提取效果較差且耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，因此不適合用于山羊乳房炎病原分子檢測(cè)時(shí)DNA的提取。