郭秉鑫，楊發(fā)龍，刀筱芳

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

結(jié)膜支原體(Mycoplasmaconjunctivae,Mco)屬柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是引起羊傳染性角膜結(jié)膜炎(Infectious keratoconjunctivitis,IKC) 最主要的病原。該病原最早于1968年由Surman在澳大利亞從患病綿羊眼部分離出來，并由Barile M F等[1]于1972年對其進(jìn)行描述并命名。IKC俗稱“紅眼病”，以結(jié)膜和角膜發(fā)炎并伴有大量流淚為特征。在該病早期階段，病畜表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)的結(jié)膜炎及血管充血，隨著病情的發(fā)展會(huì)產(chǎn)生黏膜膠質(zhì)性結(jié)膜炎和角膜潰瘍，在疾病最晚期，角膜混濁甚至穿孔。IKC對圈養(yǎng)綿羊和山羊的危害較小，但對放養(yǎng)和野生動(dòng)物危害較大。野外情況下，動(dòng)物感染失明后找不到充足的食物,造成消瘦、營養(yǎng)不良，甚至?xí)膽已碌?，這也是IKC死亡率可以達(dá)到30%的原因[2]。家養(yǎng)羊群中，IKC雖然不易直接導(dǎo)致死亡，但由于影響患病羊的采食而導(dǎo)致其生長緩慢和掉膘，降低生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。

結(jié)膜支原體作為IKC的主要病原，為了有效對該病進(jìn)行防控，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其生物學(xué)特性、診斷技術(shù)及傳播機(jī)制等進(jìn)行了一系列的研究。本文對結(jié)膜支原體的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，旨在總結(jié)國內(nèi)外對該病原的研究現(xiàn)狀，以促進(jìn)對IKC的有效防治。

1 結(jié)膜支原體與IKC發(fā)生的相關(guān)性

首次報(bào)道的IKC暴發(fā)于1916年奧地利阿爾卑斯山的巖羚羊中[2]，此后相繼在家養(yǎng)的綿羊、山羊及歐洲盤羊等羊亞科中均有報(bào)道。針對IKC的病原，起初存在較大的爭議，包括羊?qū)俨继m漢氏菌、鸚鵡熱衣原體、結(jié)膜立克次體和金黃色葡萄球菌等都曾被認(rèn)為是引起IKC的病原體。早在1994年，Dagnall G J R[3]就將羊?qū)俨继m漢氏菌、結(jié)膜支原體和鸚鵡熱衣原體同時(shí)接種羔羊，從而復(fù)制結(jié)膜炎病例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受感染羊角膜結(jié)膜炎的嚴(yán)重程度與結(jié)膜支原體有關(guān)，在表現(xiàn)出輕度結(jié)膜炎癥狀的動(dòng)物中不能再分離出鸚鵡熱衣原體。Giacometti M等[4]對3只阿爾卑斯野山羊接種了從綿羊中分離出來的結(jié)膜支原體后引起了結(jié)膜炎的發(fā)生，并且第4只未進(jìn)行人工感染的野山羊也因接觸感染動(dòng)物而發(fā)生了相同的以漿液性至黏液性淚液為特征的結(jié)膜炎癥狀，且從感染動(dòng)物中僅能檢測到結(jié)膜支原體，而沒有發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體和綿羊布蘭漢氏菌等其他可能導(dǎo)致結(jié)膜炎或角膜炎的病原體。Motha M X等[5]在對新西蘭5個(gè)發(fā)生嚴(yán)重IKC的羊群進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果顯示，3/5的病畜用PCR方法能檢測出結(jié)膜支原體DNA，所有病畜血清中均能檢出結(jié)膜支原體抗體，僅從1只患病綿羊的結(jié)膜拭子中分離出1株綿羊布蘭漢氏菌(Branhamellaovis)。此外，F(xiàn)ernández-Aguilar X等[6]通過qPCR對巴基斯坦綿羊和山羊的眼拭子進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示，無論在綿羊還是山羊中，結(jié)膜支原體的檢出率均明顯大于衣原體，并且發(fā)現(xiàn)衣原體只有與結(jié)膜支原體混合感染時(shí)才引起IKC相關(guān)癥狀。在2017年，Hsu P C等[7]報(bào)道了一起在我國臺灣地區(qū)奶山羊養(yǎng)殖場內(nèi)暴發(fā)傳染性角膜結(jié)膜炎的病例，并通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)其病原為結(jié)膜支原體。因此，上述這些研究均表明結(jié)膜支原體是引起家養(yǎng)綿羊和山羊、巖羚羊、野山羊和其他羊亞科感染IKC的主要病原體。

該病原目前在全球范圍內(nèi)廣泛流行，包括瑞士[8]、芬蘭[9]、新西蘭[5]、西班牙[10]和巴基斯坦[6]等國家都報(bào)道了因結(jié)膜支原體感染綿羊、山羊、阿爾卑斯巖羚羊以及歐洲盤羊等羊亞科并引起IKC的病例。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)挪威的一個(gè)麝牛種群也暴發(fā)了角膜結(jié)膜炎，并通過對其眼拭子樣本進(jìn)行DNA序列分析發(fā)現(xiàn)其病原為結(jié)膜支原體。這說明結(jié)膜支原體不僅僅感染綿羊和山羊等羊亞科動(dòng)物，也可能感染其他反芻動(dòng)物[11]。

在我國，山羊和綿羊中IKC流行廣泛，除上述Hsu P S等[7]在我國臺灣省奶山羊感染結(jié)膜支原體導(dǎo)致IKC發(fā)生的報(bào)道外，在重慶、廣西、海南、青海等地均有暴發(fā)IKC的病例[12-15]，并發(fā)現(xiàn)該病雖然對羊群的直接致死率偏低，但傳播速度較快，如不進(jìn)行及時(shí)的控制，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)向整個(gè)羊群傳播蔓延，從而給羊養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，我國針對IKC的相關(guān)研究仍然十分有限，多數(shù)僅從流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等進(jìn)行了初步的診斷，而對其進(jìn)行病原分離和鑒定報(bào)道甚少，也缺乏我國結(jié)膜炎支原體病原特征的相關(guān)研究。但我國相關(guān)學(xué)者提出了許多中醫(yī)治療、西醫(yī)治療及中西醫(yī)結(jié)合治療羊IKC的方法，具有一定的效果[12,16-17]。

2 病原分子生物學(xué)特征

支原體在系統(tǒng)發(fā)育上與革蘭氏陽性梭菌密切相關(guān)，是能自我復(fù)制和自主生活的最小的原核生物，基因組在0.6 Mbp～1.3 Mbp之間。由于其有限的遺傳信息，僅表達(dá)少量的細(xì)胞蛋白，缺乏許多活性酶和代謝途徑[2]。Pettersson B等[18]基于16S rRNA基因?qū)Y(jié)膜支原體的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其與牛眼支原體(M.bovoculi)具有最近的親緣關(guān)系，同時(shí)和綿羊肺炎支原體(M.ovipneumoniae)及豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)等共處于一個(gè)大的分支。為了進(jìn)一步了解結(jié)膜支原體分子生物學(xué)特性，Calderon-Copete S P等[19]對結(jié)膜支原體全基因組進(jìn)行測序、注釋及分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)膜支原體基因組是由1條染色體組成，大小約為0.9 Mbp，G+C含量為29%，共編碼734個(gè)基因。其中699個(gè)被預(yù)測為蛋白質(zhì)的編碼序列，其中49%的基因的功能已知，5.6%的基因被注釋為“假定蛋白”，在剩下的45%的基因中，有25%則被認(rèn)為是結(jié)膜支原體所特有的。

黏附素在支原體的致病過程中起著核心作用，其介導(dǎo)支原體對宿主細(xì)胞的黏附、定植和進(jìn)一步致病[20]。目前,發(fā)現(xiàn)2個(gè)結(jié)膜支原體的重要黏附素分子，即富含絲氨酸的脂蛋白S(lipoprotein S，LppS)和脂蛋白T(lipoprotein T，LppT)。Belloy L等[21]對lppS進(jìn)行基因克隆和序列分析表明，該基因編碼一種前體膜蛋白。成熟的LppS蛋白表觀分子質(zhì)量為150 ku，具有一個(gè)富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域，由41個(gè)氨基酸組成，其中有37個(gè)(90.2%)是絲氨酸殘基，并且這些殘基中有27個(gè)是連續(xù)的。體外黏附試驗(yàn)表明，該蛋白能黏附在羔羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞上，針對LppS的特異性IgG的Fab片段可抑制結(jié)膜支原體對細(xì)胞的黏附作用。

LppT和LppS是由一個(gè)操縱子編碼，為一個(gè)由947個(gè)氨基酸組成的膜蛋白，分子質(zhì)量為105 ku。在其氨基末端有一個(gè)由34個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號肽序列，隨后是兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，與豬肺炎支原體的膜蛋白p76和p110有明顯的相似性。lppT基因缺乏啟動(dòng)子，而是與lppS共轉(zhuǎn)錄，這提示LppS與LppT兩者的功能密切相關(guān)[21]。2010年，Zimmermann L等[22]在對LppT的研究中發(fā)現(xiàn)，LppT中的RGD(Arg-Gly-Asp)基序是結(jié)膜支原體與宿主細(xì)胞結(jié)合的特異性位點(diǎn)，在結(jié)膜支原體的黏附作用中起著至關(guān)重要的作用，抗LppT 的IgG Fab片段同樣能阻斷結(jié)膜支原體對細(xì)胞的黏附過程。研究還發(fā)現(xiàn)，采用針對LppS或LppT特異性IgG的Fab片段，阻斷其中一種蛋白，會(huì)導(dǎo)致LppS-LppT介導(dǎo)的黏附功能失活。這與豬肺炎支原體232菌株的蛋白p146和mhp683之間的關(guān)系類似，而這兩個(gè)蛋白也同樣由一個(gè)操縱子編碼[20]。說明結(jié)膜支原體的LppS和LppT在其黏附宿主細(xì)胞的過程至關(guān)重要且協(xié)同發(fā)揮作用。

3 感染和致病機(jī)制

相關(guān)研究表明，結(jié)膜支原體引起IKC的嚴(yán)重程度與眼中結(jié)膜支原體的數(shù)量有關(guān)，與衣原體等其他病原體的混合感染也可能會(huì)加劇臨床癥狀，動(dòng)物懷孕和寒冷的天氣等因素也可能是影響IKC嚴(yán)重程度的重要因素[5]。就傳播途徑而言，通常認(rèn)為結(jié)膜支原體主要通過直接接觸傳播，而蒼蠅等也可能起到間接傳播的作用[2,23]。雖然其主要存在于感染動(dòng)物的眼部，而Aguilar X F等[23]通過qPCR的方法，在羊的鼻拭子和耳拭子中也檢測到了結(jié)膜支原體DNA，說明結(jié)膜支原體可能存在其他的傳播機(jī)制。

目前，針對結(jié)膜支原體的致病機(jī)制研究甚少。一般而言，支原體由于缺乏細(xì)胞壁，其致病機(jī)制與大多數(shù)致病性細(xì)菌有著很大的差異。其一般不產(chǎn)生毒素、溶細(xì)胞素及侵襲素等典型的毒力因子，主要是通過黏附素附著于宿主細(xì)胞表面，并通過有毒中間代謝產(chǎn)物對宿主細(xì)胞造成損傷[24]。由于LppS和LppT具有介導(dǎo)結(jié)膜支原體黏附的作用，在結(jié)膜支原體的致病性中起著至關(guān)重要的作用[21-22]，是目前已知的兩個(gè)重要的毒力因子。

研究表明，甘油的攝取及代謝過程與支原體的毒力密切相關(guān)[25]，也是目前較為明確的支原體致病機(jī)制之一。在該機(jī)制中，支原體黏附于宿主細(xì)胞后，攝取甘油并氧化的過程中所形成的副產(chǎn)物H2O2可直接對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，造成細(xì)胞損傷和產(chǎn)生炎癥(圖1)。

圖1 支原體甘油代謝途經(jīng)[26]

該途徑始于細(xì)胞膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Sn-glycerol-3-phosphate transport system permease)對甘油的吸收，然后甘油被磷酸化為3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)，或者由丙三醇吸收促進(jìn)蛋白(glycerol uptake facilitator protein，GlpF)攝入甘油，并由丙三醇激酶(glycerol kinase facilitator protein，GlpK)磷酸化為G3P，隨后G3P在O2存在下被3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GlpO)氧化為磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)，并生成分子H2O2，而H2O2通過GlpO跨膜蛋白直接釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24,26]。Calderon-Copete S P等[19]對5種支原體基因組序列的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分類并對比，發(fā)現(xiàn)結(jié)膜支原體中碳水化合物和運(yùn)輸代謝明顯偏低，這提示結(jié)膜支原體具有強(qiáng)大的甘油代謝途徑。通過對結(jié)膜支原體基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其同樣具有GlpO、GlpK、GlpF和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，說明結(jié)膜支原體擁有上述代謝途徑。此外，Calderon-Copete S P等[19]還發(fā)現(xiàn)結(jié)膜支原體中有3種與豬痢短螺旋體(Brachyspirahyodysenteriea)毒素高度相似的蛋白，分別是溶血素A(hemolysin A，HlyA)、溶血素B(hemolysin B，HlyB)和溶血素C(hemolysin C，HlyC)，雖然這些蛋白在其他的支原體中不是致病所必須的，但不排除這些毒素與結(jié)膜支原體的致病性有關(guān)。

4 結(jié)膜支原體檢測方法

4.1 病原分離培養(yǎng)

對病原進(jìn)行分離培養(yǎng)是診斷支原體感染的經(jīng)典方法，也可以認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”。不同支原體所需要的營養(yǎng)條件也具有一定差異，因而選擇合適的培養(yǎng)基對支原體的培養(yǎng)顯得尤為重要。目前，結(jié)膜支原體的培養(yǎng)通常在含有200 mL/L馬血清、25 g/L酵母膏和10 g/L的葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)支原體PPLO肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行，可加入酚紅指示劑以便觀察顏色以及青霉素和醋酸鉈作為抗菌劑[7-8]。除此之外，改良的Hayflick培養(yǎng)基和Eaton培養(yǎng)基也可以很好地培養(yǎng)結(jié)膜支原體[1,5]。雖然很多學(xué)者采用分離培養(yǎng)的方法對結(jié)膜支原體進(jìn)行了鑒定，但該方法易受到細(xì)菌等其他微生物的污染，分離難度較大，成功率很低，且病原體的培養(yǎng)過程很繁瑣，生長周期長，營養(yǎng)條件要求高，需要實(shí)驗(yàn)人員具備專業(yè)的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。特別是在一些養(yǎng)殖場中由于大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類等抗生素的大量使用，會(huì)抑制其體外生長，也是不能成功分離出結(jié)膜支原體的重要原因之一[5]。此外，即使分離和培養(yǎng)成功后，仍需要用其他方法對其進(jìn)行鑒定。因此，病原分離培養(yǎng)的方法并不適用于臨床上結(jié)膜支原體感染的及時(shí)診斷。

4.2 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法作為一種傳統(tǒng)的診斷技術(shù)，具有簡便、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法已被學(xué)者廣泛用于支原體的檢測[27]。相比于其他支原體，用于結(jié)膜支原體診斷的血清學(xué)方法報(bào)道甚少。2011年，Belloy L等[28]分析了綿羊中結(jié)膜支原體和綿羊肺炎支原體之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生交叉反應(yīng)主要?dú)w因于42 ku和83 ku的兩種強(qiáng)抗原蛋白，并利用Tween-20提取了結(jié)膜支原體HRC/581T菌株的膜蛋白作為特異性抗原，建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，用于鑒定綿羊群體中的結(jié)膜支原體。次年，Giacometti M等[8]也基于Belloy L等[28]的方法，建立了用于檢測阿爾卑斯山巖羚羊血清中特異性結(jié)膜支原體抗體的間接ELISA方法。但由于感染羊的支原體種類較多，且相關(guān)支原體之間抗原的相似性很高，會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的血清學(xué)交叉反應(yīng)，往往會(huì)影響診斷的準(zhǔn)確性[28]。同時(shí)，血清學(xué)方法主要是檢測感染抗體，無法直接反映動(dòng)物的感染狀況，因此是一種間接診斷方法，需要結(jié)合臨床癥狀等進(jìn)行綜合判斷。

4.3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)檢測具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。針對結(jié)膜支原體，已建立了普通PCR、套式PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種特異性分子檢測方法。1999年，Giacometti M等[29]基于結(jié)膜支原體rrs基因(16s rRNA)的獨(dú)特序列，設(shè)計(jì)了一對特異性引物McoR1和McoF1，建立了鑒定結(jié)膜支原體的普通PCR，該方法成功鑒定出來自不同國家的山羊、綿羊、野山羊及巖羚羊源的結(jié)膜支原體分離株，而對其他支原體擴(kuò)增具有很高的特異性。隨后發(fā)現(xiàn)這種普通PCR雖然能用于結(jié)膜支原體的快速、特異的鑒定，但該方法的靈敏度不高，僅能用于對結(jié)膜支原體分離株培養(yǎng)物的鑒定。對此，又建立了一種套式PCR，首先用一對支原體屬通用引物MOLIGEN1-L和16UNI-R進(jìn)行第一步擴(kuò)增，然后再利用結(jié)膜支原體特異性引物McoR1和McoF1進(jìn)行第二步擴(kuò)增。通過比較發(fā)現(xiàn)，套式PCR與直接分離培養(yǎng)的檢測結(jié)果相當(dāng)，靈敏度卻遠(yuǎn)高于普通PCR，是普通PCR的104倍，并且可以直接用于臨床樣本的檢測。但這種方法的缺點(diǎn)是需要對樣本進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，相對較為耗時(shí)，并且在對大量樣本進(jìn)行檢測時(shí)，由于需要對第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行操作，增加了樣本間相互污染的可能性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號對反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，并可實(shí)現(xiàn)定量分析。常用的定量PCR方法有SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法。2007年，Vilei E M等[30]針對結(jié)膜支原體lppS基因5′末端設(shè)計(jì)了TaqMan熒光探針，成功建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并且通過與套式PCR進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其具有更高的靈敏性。雖然TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相比其他鑒定方法顯示出了更高的準(zhǔn)確性，但由于其需要合成探針，成本相對較高，且需要有價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀，因此在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用受到較大的限制。

因此，針對結(jié)膜支原體的檢測，仍有必要建立更為方便、簡單或快速的新型分子檢測方法。

5 疫苗

目前，尚未見到針對結(jié)膜支原體疫苗研究的報(bào)道。但如前所述，學(xué)者們已經(jīng)鑒定出LppS、LppT等與結(jié)膜支原體黏附作用有關(guān)的膜表面脂蛋白，并發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的免疫原性，以及溶血素A、溶血素B和溶血素C等3種與豬痢短螺旋體毒素高度相似的蛋白[19,21-22]。這些與感染和致病相關(guān)的蛋白可作為候選抗原用于今后的疫苗研究中，可研制針對基于上述蛋白的重組亞單位疫苗或基因載體疫苗等，用于IKC的預(yù)防。

6 結(jié)語

結(jié)膜支原體是引起羊亞科傳染性角膜結(jié)膜炎的主要病原體，會(huì)嚴(yán)重影響羊群的健康。雖然該病原在世界范圍內(nèi)流行，但與其他重要的動(dòng)物病原性支原體相比，對結(jié)膜支原體的研究明顯滯后，特別是對其病原分子生物學(xué)特征了解甚少，對重要毒力因子和免疫原的結(jié)構(gòu)和功能缺乏了解，從而為進(jìn)一步闡明其感染和致病機(jī)制造成障礙，也不利于疫苗研制。此外，雖然目前也建立了一些針對該病原的血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，但仍存在特異性不強(qiáng)、耗時(shí)費(fèi)力等不足，因此，建立重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)及恒溫隔絕式熒光PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR) 等方便、快速的新型核酸檢測技術(shù)，對于結(jié)膜支原體的檢測和其感染的診斷具有重要的意義。

疫苗免疫接種是預(yù)防傳染病最為有效的手段之一，目前尚無任何針對結(jié)膜炎支原體的滅活苗、弱毒苗及亞單位疫苗的報(bào)道。因此，在了解其生物學(xué)特征和保護(hù)性抗原的基礎(chǔ)上，進(jìn)行疫苗創(chuàng)制應(yīng)是未來該病原研究的重要課題。