許瑞華，周應(yīng)聰，孫 瑩，王 萌，芮 弦，王靖雷，馬 睿，余四九，潘陽陽*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠，甘肅蘭州 730046)

窖蛋白是分子質(zhì)量為17 ku～24 ku的整合膜蛋白，具有參與胞膜窖形成、細(xì)胞內(nèi)吞等生物學(xué)功能，是胞膜窖區(qū)別于其他脂筏結(jié)構(gòu)的特征性分子[1-2]。胞吞是細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的途徑之一，其通過胞膜窖完成這一生理程序[3]。而胞吞作用相關(guān)蛋白窖蛋白1(caveolin-1，Cav1)、窖蛋白2(caveolin-2，Cav2)和窖蛋白3(caveolin-3，Cav3)通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與多種信號分子之間相互作用[4-5]，進(jìn)而控制跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)[6]，其動態(tài)變化勢必影響著胚胎的發(fā)育質(zhì)量。由此可見，研究哺乳動物卵母細(xì)胞的激活及發(fā)育過程中胞吞作用相關(guān)蛋白的動態(tài)表達(dá)分析，對動物和人類輔助繁殖技術(shù)以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)化等方面有著重要的意義[7]。

哺乳動物的生理調(diào)控過程中，Caveolin基因家族的3個(gè)成員(Cav-1、2、3)，通過選擇性剪切編碼了6種窖蛋白，即Cav-1(1α、1β共2種亞型)、Cav-2(2α、2β、2γ共3種亞型)和Cav-3[8-10]。Cav1和Cav2是兩種細(xì)胞表面的穴樣內(nèi)陷中的主要膜內(nèi)在蛋白[11-13]，它們作為胞膜窖的主要成分參與了生理及病理?xiàng)l件下的胞吞作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長的調(diào)控及細(xì)胞凋亡等其他功能[14]。Cav1參與在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路和Cripto-1信號通路，且已有的對Cav1作用的研究發(fā)現(xiàn)，Cav1在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中也起著重要作用[15-16]。Cav2參與細(xì)胞的重要功能，并可在許多細(xì)胞上調(diào)節(jié)胞膜窖的數(shù)量[17-18]。

本研究旨在探索哺乳動物孤雌激活胚胎早期發(fā)育過程中胞吞作用的調(diào)控機(jī)制及其對胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響。研究工作以小鼠孤雌激活胚胎為模型，從基因和蛋白水平檢測孤雌激活胚胎發(fā)育各時(shí)期胞吞作用相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和動態(tài)分布，探明胞吞作用相關(guān)蛋白在小鼠孤雌激活胚胎附植前發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究提高早期胚胎發(fā)育能力、成活率和試管動物技術(shù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級昆明小鼠，均為雌性，4周齡～5周齡,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸研所動物中心。飼養(yǎng)于提前準(zhǔn)備好的鼠房中，溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%，自由采食、飲水，晝夜明暗交替時(shí)間12/12。

1.1.2 主要試劑 G1/G2聯(lián)合培養(yǎng)液，Vitrolife公司產(chǎn)品；胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)，Gibco公司產(chǎn)品；KSOM培養(yǎng)液，國產(chǎn)分析純試劑配制；Srcl2、細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)、透明質(zhì)酸酶,Sigma公司產(chǎn)品；微量RNA提取試劑盒,Omega公司產(chǎn)品；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒,Promega公司產(chǎn)品；SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；免疫熒光檢測、蛋白免疫印跡所用試劑，南京碧云天生物公司產(chǎn)品；蛋白免疫印跡所用抗體，博奧森公司(北京)產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀(T100TMThermal Cycler)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；超凈工作臺(CBV-1500A)，上海瑞仰凈化裝備有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；體式顯微鏡 (BX51-DP71)、熒光倒置相差顯微鏡(BX51-DP71)，Olympus公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī) (Centrifuge 5417R)，Eppendorf公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(Amersham Imager 600)，美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超排處理 選擇處于臨近發(fā)情期陰門呈淡粉紅色的雌性小鼠，于16:00～18:00腹腔注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)8 IU；注射PMSG 48 h后，每只小鼠再腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)10 IU，進(jìn)行超排處理。

1.2.2 小鼠孤雌激活胚胎的獲得及培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，采集完整生殖器官(子宮、輸卵管)和卵巢，在37℃生理鹽水中清洗2遍，移至體視顯微鏡下觀察，用針頭挑破輸卵管膨大部，采卵針吸出優(yōu)質(zhì)COCs，PBS清洗3次后移入1 g/L的透明質(zhì)酸酶中反復(fù)輕微吹打，使其脫去周圍卵丘細(xì)胞形成裸卵。將裸卵在含有胎牛血清的PBS中清洗3次，移至Srcl2+CB微滴(提前平衡)中并于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度(95%)條件下作用4 h，完成激活。

孤雌激活完成后在體視顯微鏡下觀察胚胎激活狀況,然后將其移入含10 g/L BSA的KSOM培養(yǎng)液中(每100 μL的微滴含有20個(gè)卵母細(xì)胞)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度(95%)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在處理完成后24、48、60、84 h分別收集2細(xì)胞、4-8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚時(shí)期的孤雌發(fā)育胚胎。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的小鼠Cav1、Cav2的mRNA序列，使用軟件NCBI primer-BLAST在保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增小鼠Cav1、Cav2編碼區(qū)域的基因序列引物及其RT-qPCR引物，并根據(jù)小鼠GAPDH(EU195062)基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，見表1。

表1 RT-qPCR引物信息

1.2.4 胚胎RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 對不同發(fā)育時(shí)期的孤雌發(fā)育胚胎，用微量RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，兩步法合成cDNA，置-20℃保存，以待后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測小鼠孤雌激活胚胎Cav1、Cav2基因的表達(dá) 使用熒光定量PCR檢測儀檢測Cav1、Cav2基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL，主要包含2 μL cDNA模板，上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，ddH2O 6.4 μL。具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 s；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)根據(jù)生成的熔解曲線確定擴(kuò)增特異性，采用相對定量分析法分析基因表達(dá)水平。

1.2.6 免疫熒光檢測Cav1和Cav2蛋白在不同時(shí)期胚胎中的表達(dá)定位 收集各處理組2細(xì)胞、4-8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚時(shí)期的胚胎，PBS清洗3次后，用免疫染色固定液室溫固定30 min，免疫染色封閉液封閉1 h后，使用Cav1、Cav2抗體4℃孵育過夜，PBS洗3遍，移入熒光二抗中室溫孵育1 h用于標(biāo)記目的蛋白，PBS洗3遍，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色5 min，PBS洗3遍，抗熒光猝滅劑封片，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍照。

1.2.7 Western blot檢測小鼠不同時(shí)期孤雌激活胚胎Cav1、Cav2的蛋白表達(dá) 用PBS清洗2細(xì)胞、4-8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚時(shí)期的胚胎3遍，加入蛋白裂解液充分裂解2 h，10 000 r/min離心15 min，收集上清，置-80℃保存。100℃金屬浴15 min使蛋白質(zhì)充分變性。經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后，將目標(biāo)蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)，室溫封閉3 h，孵育一抗(4℃12 h)，PBST(PBS+tween-20)清洗5 min×6次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗20 min×3次，電化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光2 min～5 min，待蛋白條清晰時(shí)拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠孤雌激活胚胎體外發(fā)育情況

將收集好的卵母細(xì)胞在體式顯微鏡下激活后，體外培養(yǎng)使其繼續(xù)發(fā)育，在24、48、60、84 h時(shí)依次觀察到2細(xì)胞胚胎(圖1A)、4-8細(xì)胞胚胎(圖1B)、桑椹胚(圖1C)、囊胚(圖1D)，此時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和囊胚腔已在孤雌激活胚胎內(nèi)形成。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，不同時(shí)期胚胎的發(fā)育率分別為2細(xì)胞胚胎45.64%(110/241)、4-8細(xì)胞胚胎82.72%(91/110)、桑椹胚86.81%(79/91)和囊胚72.15%(57/79)。

A.2細(xì)胞期; B.4-8細(xì)胞期; C.桑椹胚期; D.囊胚期

2.2 不同發(fā)育時(shí)期孤雌激活胚胎Cav1、Cav2基因表達(dá)情況

利用普通PCR方法從基因水平檢測孤雌激活胚胎2-4細(xì)胞、4-8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚時(shí)期的胚胎中Cav1、Cav2的表達(dá)水平。電泳結(jié)果顯示，目的條帶單一清晰，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，說明引物及模板特異性良好，可以進(jìn)行后續(xù)研究(圖2)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示Cav1、Cav2主要在桑椹胚時(shí)期表達(dá)，囊胚與4細(xì)胞胚胎次之，在2細(xì)胞胚胎中的表達(dá)量最低(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.桑葚胚；2.囊胚；3.4-8細(xì)胞；4.2細(xì)胞

A.Cav1基因的相對表達(dá)水平；B.Cav2基因的相對表達(dá)水平A.Relative expression level of Cav1；B.Relative expression level of Cav2

2.3 不同發(fā)育時(shí)期孤雌激活胚胎中Cav1和Cav2蛋白的相對表達(dá)量

蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cav1、Cav2在胚胎不同時(shí)期均有表達(dá)(圖4A)。其中，桑椹胚時(shí)期Cav1、Cav2的表達(dá)量最高，囊胚與4細(xì)胞胚胎次之、2細(xì)胞胚胎最低(圖4B)。

A.小鼠孤雌激活胚胎不同發(fā)育時(shí)期Cav1、Cav2WB檢測；B.小鼠孤雌激活胚胎不同發(fā)育時(shí)期Cav1、Cav2相對表達(dá)量；1.2-細(xì)胞; 2.4-細(xì)胞; 3.桑椹胚; 4.囊胚

2.4 不同發(fā)育時(shí)期孤雌激活胚胎Cav1、Cav2免疫熒光檢測結(jié)果

免疫熒光技術(shù)檢測顯示，在不同發(fā)育時(shí)期胚胎中均可檢測到Cav1、Cav2的表達(dá)，桑椹胚和囊胚中熒光強(qiáng)度最高，2細(xì)胞胚胎最弱，且其主要定位在細(xì)胞質(zhì)，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中Cav1和Cav2的熒光強(qiáng)度高于滋養(yǎng)層細(xì)胞(圖5)。

A.Cav1免疫熒光染色結(jié)果；B.Cav2免疫熒光染色結(jié)果A.Cav1 immunofluorescence staining results；B.Cav2 immunofluorescence staining results

3 討論

孤雌激活是指雌性動物產(chǎn)生的卵子在沒有雄性配子的參與下就能形成胚胎并可進(jìn)一步發(fā)育，又被稱為孤雌生殖，孤雌激活胚胎具有類似于正常精卵結(jié)合胚胎的發(fā)育能力[19]，能夠進(jìn)一步卵裂發(fā)育成為2-4細(xì)胞、4-8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚，因此本研究以小鼠孤雌激活胚胎為模型，旨在探討哺乳動物胚胎早期發(fā)育過程中胞吞作用的生理調(diào)控機(jī)制。分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇與磷脂的運(yùn)輸、分選等生理調(diào)控作為哺乳動物胚胎早期發(fā)育過程中的關(guān)鍵生物學(xué)事件，可影響胚胎的發(fā)育質(zhì)量。窖蛋白Cav1可與多種信號分子相互作用，形成不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控這些信號分子，并通過對細(xì)胞內(nèi)分子信號的調(diào)控，啟動細(xì)胞遷移，從而影響胚胎的形成和發(fā)育[20-21]。細(xì)胞發(fā)育與生長過程中窖蛋白不僅在細(xì)胞膜運(yùn)輸系統(tǒng)中不可或缺，而且參與細(xì)胞的分析信號調(diào)節(jié)[7]。

Caveolae是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，各種信號分子可聚集在Caveolae區(qū)，通過不同的模式形成組裝平臺，發(fā)揮生理調(diào)控。Cav1作為信號分子的支架蛋白和負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，在各種組織的上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜上主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)分子[22-23]，如介導(dǎo)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和流出等。Cav2的腳手架區(qū)域無抑制活性[24]，但是否存在其他的其他信號抑制區(qū)域仍需證實(shí)。大多數(shù)動物組織細(xì)胞中Cav2與Cav1形成異源二聚體，進(jìn)行共表達(dá)[25]。Cav1與Cav2形成的窖蛋白組裝平臺，不僅在細(xì)胞內(nèi)外運(yùn)輸中起重要作用，在細(xì)胞的生長、囊泡運(yùn)輸?shù)壬镞^程也發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，兩者形成的復(fù)合體對細(xì)胞胞吞作用的發(fā)揮也至關(guān)重要[7-15]。本研究以Cav2與Cav1為靶標(biāo)，探明了小鼠早期胚胎發(fā)育胞吞作用的動態(tài)變化，為細(xì)胞胞吞作用參與哺乳動物胚胎發(fā)育生理調(diào)控提供理論依據(jù)。

通過體外生產(chǎn)孤雌激活胚胎，檢測不同發(fā)育階段胞吞作用相關(guān)蛋白(Cav1、Cav2)的動態(tài)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在囊胚期和桑葚胚中Cav1、Cav2的表達(dá)水平最高，可見隨著胚胎的發(fā)育，胚胎內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增多，因營養(yǎng)競爭等生理因素細(xì)胞損傷啟動。而該階段Cav1、Cav2表達(dá)的增加揭示胞吞生理調(diào)控可以在該階段保護(hù)細(xì)胞的損傷，從而維持胚胎的高質(zhì)量發(fā)育。囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)是胎兒發(fā)育的主要來源細(xì)胞，滋養(yǎng)層(tropheetoderm,TE)細(xì)胞主要發(fā)育成為胎兒的胎膜和胎盤，囊胚形成后,胚胎的極性在形態(tài)上顯現(xiàn),形成具有明顯差別的2個(gè)細(xì)胞群,位于囊胚內(nèi)部的ICM仍然保持多能性,未來發(fā)育成胚體、卵黃囊、尿囊和羊膜等,外部的細(xì)胞分化為滋養(yǎng)外胚層,具有典型上皮性,滋養(yǎng)外胚層游離邊緣具有微絨毛和側(cè)面具有特殊蛋白復(fù)合物的分布,包括緊密連接和黏附連接,滋養(yǎng)外胚層增殖后形成胎盤和絨毛膜等胚外器官[26-27]。且在二者分裂分化過程中，涉及到許多基因的表達(dá)和細(xì)胞因子的參與，而兩者間胞吞作用相關(guān)蛋白Cav1、Cav2的表達(dá)必定與二者朝著不同方向發(fā)展，最終形成完整個(gè)體有關(guān)[28]。兩者的平衡對于胎兒的發(fā)育和胚胎的附植至關(guān)重要，研究結(jié)果顯示，囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞均可表達(dá)Cav1、Cav2蛋白，推測兩者的表達(dá)可能有助于通過胞吞作用調(diào)控囊胚細(xì)胞平衡，維持囊胚質(zhì)量。此外，囊胚中發(fā)現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中Cav1和Cav2的熒光強(qiáng)度高于滋養(yǎng)層細(xì)胞，可見胞吞調(diào)控對胚胎的發(fā)育更為重要，結(jié)果為早期胚胎發(fā)育和囊胚質(zhì)量的調(diào)控提供了一個(gè)新的突破點(diǎn)，有助于通過相關(guān)條件改變調(diào)控胚胎發(fā)育的胞吞生理功能，對動物輔助繁殖技術(shù)有重要意義。

胞吞作用相關(guān)蛋白Cav1、Cav2可參與小鼠早期胚胎發(fā)育的整個(gè)生理過程調(diào)控，但在不同的發(fā)育階段存在一定差異，其中桑椹胚和囊胚中生理調(diào)控作用更為顯著。囊胚中不同的細(xì)胞類型胞吞作用相關(guān)蛋白的生理功能也存在一定差異，其對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的保護(hù)機(jī)制更為明顯。研究結(jié)果可為探索胞吞作用參與哺乳動物胚胎早期發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供參考。