楊齊之賢，易蓉鑫，周祖靈，孫永科，楊玉艾

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接觸性、致死性傳染病，我國豬瘟呈現(xiàn)向非典型性方向發(fā)展的特征[1]。研究表明，核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)與病毒感染有著密切的關(guān)系，在抗病毒免疫和炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2]。

當(dāng)細(xì)胞處于未激活狀態(tài)時(shí)，NF-κB與IκB蛋白以無活性的方式存在于細(xì)胞中，當(dāng)IKK復(fù)合物接收的信號(hào)被傳遞到IκB蛋白上，使IκBα蛋白磷酸化后降解，活化p65蛋白(RelA)，p50/p65結(jié)合而成的異二聚體表現(xiàn)出NF-κB活性從而被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)，NF-κB通路的經(jīng)典途徑被激活[3]，與經(jīng)典途徑相關(guān)的基因是NFKBIA、IKBKB、RelA基因。IKKα蛋白是IKK復(fù)合物的亞基之一，IKKα能夠調(diào)控NF-κB的活性，并且激活NF-κB信號(hào)通路下游相關(guān)基因的表達(dá)[4]，是非經(jīng)典途徑必須亞基之一，因此，檢測編碼IKKα的CHUK基因是關(guān)鍵。

Lee S M等[5]研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)激活了NF-κB途徑。Chen L J等[6]研究表明，CSFV感染PK-15細(xì)胞不會(huì)影響NF-κB信號(hào)通路，并且p65/RelA沒有明顯從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。Bensaude E等[7]研究表明，CSFV感染會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，并導(dǎo)致各種促炎因子上調(diào)。目前，關(guān)于CSFV感染豬睪丸上皮細(xì)胞系(swine testis，ST)對(duì)NF-κB相關(guān)基因表達(dá)的影響還尚未見報(bào)道，CSFV感染ST細(xì)胞后是否激活了NF-κB通路的經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑還不明確。因此，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR的方法檢測CSFV感染ST細(xì)胞后NF-κB信號(hào)通路CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因mRNA表達(dá)量的變化情況，從基因水平分析CSFV感染ST細(xì)胞后對(duì)NF-κB信號(hào)通路上、下游的影響[8-9]，并通過Western blot檢測了p65蛋白在胞漿和胞核內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證CSFV感染ST細(xì)胞后激活NF-κB通路的經(jīng)典途徑。本研究初步探索了機(jī)體感染豬瘟病毒對(duì)NF-κB通路上、下游炎性因子的影響，為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 豬睪丸上皮細(xì)胞系(ST)和豬瘟病毒(CSFV)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞保存中心保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液、新生胎牛血清、胰蛋白酶，HyClone公司產(chǎn)品；ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 5 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，羅氏公司產(chǎn)品；Trizol、TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 倒置相差顯微鏡,明美光電有限公司產(chǎn)品；CO2恒溫培養(yǎng)箱,美墨爾特貿(mào)易有限公司產(chǎn)品； PCR儀,東勝國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；電泳凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀,帝肯貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ST細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 在無菌離心管中加入9 mL DMEM培養(yǎng)液備用，從液氮罐中取出凍存的ST細(xì)胞迅速放入40℃水浴中溶化至冰水混合狀態(tài)，輕輕吹打數(shù)次轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的離心管中，1 000 r/min室溫離心3 min，將沉淀轉(zhuǎn)入含有100 mL/L血清的DMEM中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)36 h～48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，在細(xì)胞呈現(xiàn)單層生長時(shí)傳代。棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化10 min～15 min，細(xì)胞大部分脫落后加入血清終止消化，反復(fù)吹打至細(xì)胞成單個(gè)，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測CSFV對(duì)ST細(xì)胞增殖影響 取對(duì)數(shù)生長期的ST細(xì)胞，用預(yù)熱至37℃ D-hank's液反復(fù)沖洗2次～3次。用2.5 g/L胰蛋白酶1 mL消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min室溫離心5 min，用培養(yǎng)液重懸離心后的細(xì)胞，然后每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及飽和濕度條件下孵育。細(xì)胞約長成80%的豐度時(shí)接種不同濃度的CSFV(0.01、0.05、0.1、0.5 MOI的濃度)，每一濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，陰性對(duì)照組為不加CSFV，空白對(duì)照組為不加細(xì)胞只加CSFV。吸附1 h(期間每15 min輕輕晃動(dòng)1次)。用D-hank's洗去未吸附的病毒，然后用含20 mL/L胎牛血清的DMEM維持液培養(yǎng)細(xì)胞，于0、12、24、48、72 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育。直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解。通常37℃孵育4 h左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。在570 nm測定吸光度。

1.2.3 CSFV的接種與培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的ST細(xì)胞，接種CSFV，吸附1 h后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(含20 mL/L血清)10 mL 作用4、8、12、16、24、48 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 總RNA的提取和cDNA的合成 取對(duì)數(shù)生長期的ST細(xì)胞，接種CSFV，吸附1 h后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(含20 mL/L血清)10 mL 作用4、8、12、16、24、48 h后收集細(xì)胞，參照北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒的說明書的步驟提取總RNA，提取完成后進(jìn)行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×EasyScript?All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Rwmover 1 μL，Total mRNA 2 μL，RNase-free water 13 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 15 min，85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物的合成 參考GenBank公布的豬的CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因的序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的上、下游引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因PCR擴(kuò)增 參照北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒的說明書的步驟進(jìn)行，PCR擴(kuò)增體系：2×EasyTaq?PCR SuperMix 12.5 μL，Template 1 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，nuclease-free water 補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.7CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因熒光定量PCR擴(kuò)增 根據(jù)每一個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)參照質(zhì)粒，按測定計(jì)算的分子數(shù)，作相應(yīng)倍比稀釋使其2 μL分別含有質(zhì)粒分子數(shù)為102、103、104、105、106、107，然后進(jìn)行模板標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，將提取的樣品總RNA 1 000 ng反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和稀釋的基因標(biāo)準(zhǔn)參照質(zhì)粒分別加入熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。qPCR擴(kuò)增體系為：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Template 2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ddH2O 7 μL補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ s，共45個(gè)循環(huán)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用2-△△CT法計(jì)算各個(gè)樣品相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。前提是內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率與目的基因的擴(kuò)增效率基本一致，即可以用以下的公式對(duì)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算：mRNA的表達(dá)量=2-△△CT。

1.2.9 Western blot 胞漿和胞核蛋白的提取參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書的步驟進(jìn)行：收集CSFV感染24 h的ST細(xì)胞，用PBS洗1遍，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，500 r/min離心2 min～3 min，棄上清留沉淀備用。加入200 μL的提前與100 mmol/L PMSF混勻的漿蛋白抽提試劑，渦旋混合15 s使細(xì)胞沉淀與溶液充分混勻形成單細(xì)胞懸液；冰浴10 min；劇烈渦旋10 s，4℃、14 000 r/min離心10 min；吸取上清至預(yù)冷的EP管中備用，上清即為胞漿蛋白；完全吸取上清后向沉淀中加入100 μL蛋白抽提試劑，混勻即為細(xì)胞核。用BCA法測定蛋白濃度。

將樣品加入6×buffer中煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清加入SDS-PAGE泳道中，恒流跑膠；電泳完畢后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印12 h，然后用脫脂奶粉封閉1 h；用TBST緩沖液洗膜3次～4次，每次5 min；4℃過夜孵育一抗；TBST洗膜3次，每次5 min；加入二抗孵育1 h；TBST洗膜，每次10 min；將PVDF膜加入顯色液中避光顯色30 min，用顯影劑顯像，定影劑定影后保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測CSFV對(duì)ST細(xì)胞增殖影響

根據(jù)MTT法的檢測，發(fā)現(xiàn)0.05 MOI及以上病毒滴度的CSFV感染ST細(xì)胞24 h，對(duì)抑制ST細(xì)胞的生長達(dá)到50%，而0.01 MOI的CSFV感染ST細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞的生長活性顯著下降至20%。因此，在接下來的試驗(yàn)中都選擇0.01 MOI的劑量接毒(圖1)。

圖1 CSFV感染對(duì)ST細(xì)胞活性的影響

2.2 CSFV普通PCR擴(kuò)增

CSFV經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得單一且符合預(yù)期大小的條帶，說明CSFV感染ST細(xì)胞，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.CSFV感染4 h; 2.CSFV感染8 h; 3.CSFV感染12 h; 4.CSFV感染16 h; 5.CSFV感染24 h; 6.CSFV感染48 h; 7.陽性對(duì)照

2.3 NFKBIA、RelA、IKBKB、CHUK基因的PCR擴(kuò)增

NFKBIA基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，各PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得單一且符合預(yù)期大小的條帶，說明引物具有特異性，條帶大小為108 bp(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.CSFV感染4 h; 2.CSFV感染8 h; 3.CSFV感染12 h; 4.CSFV感染16 h; 5.CSFV感染24 h; 6.CSFV感染48 h

RelA基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，各PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得單一且符合預(yù)期大小的條帶，說明引物具有特異性，條帶大小為145 bp(圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.CSFV感染4 h; 2.CSFV感染8 h; 3.CSFV感染12 h; 4.CSFV感染16 h; 5.CSFV感染24 h; 6.CSFV感染48 h

IKBKB基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，各PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得單一且符合預(yù)期大小的條帶，說明引物具有特異性，條帶大小為110 bp(圖5)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.CSFV感染4 h; 2.CSFV感染8 h; 3.CSFV感染12 h; 4.CSFV感染16 h; 5.CSFV感染24 h; 6.CSFV感染48 h

CHUK基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，各PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得單一且符合預(yù)期大小的條帶，說明引物具有特異性，條帶大小為101 bp(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.CSFV感染4 h; 2.CSFV感染8 h; 3.CSFV感染12 h; 4.CSFV感染16 h; 5.CSFV感染24 h; 6.CSFV感染48 h

2.4 NFKBIA、RelA、IKBKB、CHUK基因的轉(zhuǎn)錄

CSFV在感染ST細(xì)胞后，NFKBIA基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)；NFKBIA基因的mRNA表達(dá)在感染后4 h呈現(xiàn)明顯的持續(xù)下降的趨勢， 差異顯著(P<0.05)(圖7)；

圖7 不同時(shí)間CSFV感染 NFKBIA mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

CSFV在感染ST細(xì)胞后，RelA基因的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)(圖8)。

圖8 不同時(shí)間CSFV感染 RelA mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

CSFV在感染ST細(xì)胞后，IKBKB基因的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，差異顯著(P<0.05)(圖9)；

圖9 不同時(shí)間CSFV感染IKBKB mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

CSFV在感染ST細(xì)胞后，CHUK基因的mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，差異顯著(P<0.05)(圖10)。

圖10 不同時(shí)間CSFV感染CHUK mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

2.5 Western blot檢測p65蛋白

CSFV在感染ST細(xì)胞24 h后，提取胞漿和胞核蛋白，結(jié)果表明p65蛋白在胞漿和胞核中均表達(dá)，p65蛋白入核，說明NF-κB通路的經(jīng)典途徑被激活，進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光定量PCR的結(jié)果(圖11)。

圖11 p65和p-p65的表達(dá)

3 討論

目前研究表明,病毒可以控制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，NF-κB途徑是許多病毒的常見靶標(biāo)，在炎癥、先天性免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和細(xì)胞存活中起關(guān)鍵作用[10]。病毒與宿主之間的相互作用可能導(dǎo)致NF-κB途徑的激活或抑制，從而導(dǎo)致其抗病毒反應(yīng)、病毒復(fù)制能力和毒力增強(qiáng)[11]。本試驗(yàn)檢測了NF-κB通路相關(guān)炎性基因mRNA的表達(dá)量，Western blot檢測p65蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，CSFV感染ST細(xì)胞后，激活了NF-κB信號(hào)通路的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑，Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了經(jīng)典途徑的激活，證明IκBα蛋白的降解使NF-κB二聚體釋放，導(dǎo)致p65/RelA從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核移位。

Doceul V等[12]研究表明，CSFV的NPro產(chǎn)物與NF-κB的抑制劑IκB相互作用。NFKBIA基因編碼的IκBα蛋白是IκB蛋白家族成員之一，是哺乳動(dòng)物NF-κB活性最重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，NF-κB在細(xì)胞中的存在形式通常是同源是異源二聚體的形式存在，不同的二聚體識(shí)別不同的DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而引起基因的的激活、轉(zhuǎn)錄或抑制[13]。Li H G等[14]研究表明，p65亞基是病毒誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)的NF-κB的關(guān)鍵成分。Li H等[13]研究表明，p65在成年豬中的肺、脾、肝、小腸中表達(dá)水平相對(duì)較高，間接證實(shí)了p65在免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。p50/p65是最常見的二聚體存在形式，在細(xì)胞質(zhì)中，IκBα與p50/p65異源二聚體結(jié)合形成三聚體，覆蓋其DNA結(jié)合位點(diǎn)，阻止其核易位，使其以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)IκBα受到外界刺激時(shí)，IκBα在IKK復(fù)合物的作用下被磷酸化后導(dǎo)致IκBα降解，使NF-κB游離進(jìn)入細(xì)胞核從而激活其轉(zhuǎn)錄活性，NF-κB被激活后，細(xì)胞質(zhì)中的p65轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與DNA結(jié)合，使NF-κB的轉(zhuǎn)錄更加精確，并且p65的磷酸化還能促使NF-κB相關(guān)的細(xì)胞因子釋放，從而提高NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[15-18]；基因敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IKBKB基因編碼的IKKβ和IKKγ是NF-κB所必須的，并在其中發(fā)揮著重要作用[19]，并且IKKβ對(duì)IκBα的磷酸化能力比IKKα高大約60倍，是控制NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，因此IKKβ是經(jīng)典信號(hào)通路中的關(guān)鍵亞基[20]。通過熒光定量PCR對(duì)經(jīng)典途徑相關(guān)的NFKBIA、RelA、IKBKB基因檢測表明了CSFV感染ST細(xì)胞激活了NF-κB的經(jīng)典途徑，Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果。

在非經(jīng)典途徑中，NF-κB的激活主要依賴CHUK基因編碼的IKKα對(duì)前體p100或p105的加工，使其水解成為有活性的p52，完成信號(hào)通路的激活[21]。因此，本試驗(yàn)CHUK基因的mRNA表達(dá)量上升的結(jié)果可推測得到CSFV感染ST細(xì)胞可以激活NF-κB信號(hào)通路的非經(jīng)典途徑。本試驗(yàn)驗(yàn)證了豬瘟病毒感染能夠激活NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。