朱艷平，何 勇，劉 佳,2，朗夢圓，岳 鋒，郭東光，李 鵬，孫麗莎，馬廣飛，王選年

(1.新鄉(xiāng)學院生命科學與基礎醫(yī)學學院/動物疫病分子診斷河南省工程實驗室，河南新鄉(xiāng) 453003； 2.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 453000；3.新鄉(xiāng)市人民公園，河南新鄉(xiāng) 453003)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病的主要病原，PCV2感染導致豬的免疫細胞數(shù)量減少、免疫功能減弱，導致病毒在體內持續(xù)感染[1-2]。PCV2單獨或與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)混合感染后，白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)和T細胞表面程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)表達水平顯著升高，導致機體免疫功能下降[3]。自然感染PCV2時，PD-1的配體PD-L1和PD-L2的轉錄水平均上升，細胞因子IL-2和γ干擾素(IFN-γ)的轉錄水平降低，外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)增殖能力顯著降低，造成機體的免疫抑制[1,4]。因此，PCV2感染過程中PD-1/PD-L1通路激活發(fā)揮免疫負調節(jié)作用，在造成機體免疫抑制中發(fā)揮著重要作用，但是關于PCV2感染后導致PD-1/PD-L1通路激活的調節(jié)機制還不清楚。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),PCV2感染豬的PBMCs時，能夠擴增出豬白細胞介素17A(interleukin-17 A，IL-17A)基因，而正常豬PBMCs無法擴增出豬IL-17A基因[5]，這表明在PCV2感染過程中，豬IL-17A基因的表達水平升高。又有研究表明，IL-17A的分泌受IL-21的影響，這是由于PCV2感染過程中，IL-6表達水平升高并與其受體結合，作用于Th17細胞后，導致IL-17A和IL-21的表達水平上升[6]。此外，Kader M等[7]的研究結果表明，在猴免疫缺陷病毒感染早期，猴黏膜組織中 IL-17 mRNA 表達水平隨著IL-21 的表達，約上升 10倍～35 倍。又有研究顯示，口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染過程中，IFN-γ和IL-21的表達水平升高與FMDV的抗體水平升高呈顯著正相關，這表明IL-21可以提高機體的免疫反應并發(fā)揮著抗病毒作用[8]。據(jù)此，推測PCV2感染過程中，PD-1、PD-L1和IL-21的轉錄水平之間存在著直接的相關性。但是，目前關于PCV2感染過程中PD-1、PD-L1、IL-21的轉錄水平還未見相關報道。

因此，本研究以豬PCV2為研究對象，利用熒光定量PCR檢測PCV2體外感染PBMCs時對PD-1、PD-L1和IL-21的轉錄水平的影響，為進一步研究PCV2的致病機制和防控PCV2感染奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 PCV2、PRRSV、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)毒株，均由新鄉(xiāng)學院生命與基礎醫(yī)學學院和生物技術研究中心從臨床發(fā)病豬體內分離、保存。

1.1.2 試驗用動物 PCV2抗體陰性3月齡的健康豬2頭，飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)某豬場。

1.1.3 主要試劑和酶類 cDNA反轉錄試劑盒、dNTPs、TB Green Premix Ex Ⅱ，寶生物工程(大連)有限公司產品；DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產品；Trizol,北京索萊寶生物科技有限公司產品;IL-2重組蛋白，以色列PROSPEC 公司產品；SYBR Green Ⅰ試劑盒，美國Applied Biosystems公司產品。

1.1.4 熒光定量PCR引物 PD-1、PD-L1、IL-21和β-actin的熒光定量PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.1.5 主要儀器設備 微量核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Nanodrop One)、PCR反應儀(Veriti 96-Well Thermal Cycler)、熒光定量PCR儀(Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR System)，美國Thermo Fisher公司產品；倒置顯微鏡(Carl Zeiss primo vert 45510-1101-000)，德國ZEISS公司產品；電子天平(Metle Toledo PL403)，德國SaqRTorius公司產品；熒光顯微鏡(Nikon Ti -S/L100)，尼康儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs的分離及PCV2的感染

1.2.1.1 PBMCs的分離 通過前腔靜脈采集健康豬的血5 mL，加入1 mL的抗凝劑制成抗凝血，按照本實驗室建立的方法分離PBMCs[5]。將獲得的PBMCs在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2 PCV2體外感染豬PBMCs 將分離的PBMCs(經細胞計數(shù)，細胞濃度1×106個/mL)置于6孔板中，加入終濃度為6 μg/mL刀豆蛋白A(concanavalin,ConA)刺激，然后參考文獻[9]的方法，加入100 μL 100 g/L RPMI-1640培養(yǎng)基、25 IU/mL IL-2重組蛋白、4 mmol/L L-谷氨酰胺、10 μL除菌豬血漿、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將利用PK-15細胞增殖的PCV2，以100 TCID50的量感染PBMCs，設置空白細胞對照，每個試驗做3個重復，輕輕搖勻，放入37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，吸附培養(yǎng)60 min。用PBS洗去未吸附的病毒，然后加入含20 mL/L胎牛血清、無菌的PCV2抗體陰性豬血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2.2TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測PCV2方法的建立 通過建立PCV2的熒光定量PCR方法檢測PCV2的病毒載量，根據(jù)病毒載量判斷PK-15細胞增殖的PCV2能夠感染PBMCs。

1.2.2.1 PCV2目的基因組DNA陽性標準品的制備 根據(jù)PCV2的基因序列(GenBank編號：TK19404.1)，采用生物軟件Primer Premier 5.0設計PCV2特異性引物和TaqMan探針，上游引物：5′-GGAAGTAATCAATAGTGGAA-3′，下游引物：5′-ACCCCTATGTAAACTACTC-3′，探針序列：5′-(FAM) ACCATAACCCAGCCCTTCTCC (Eclipse)-3′。利用DNA提取試劑盒提取PCV2的DNA，以提取的DNA為模板進行PCR。PCR反應結束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用PCR產物構建重組陽性質粒，經測序、比對正確的樣品，作為陽性標準品，用核酸蛋白分光光度計測定質粒純度，計算質?？截悢?shù)。將獲得的質粒進行10倍倍比稀釋，稀釋度為1×102copies/μL～1×107copies/μL，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCV2TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線的建立 利用稀釋的陽性標準品，以 10-1～10-5梯度倍比稀釋作為標準模板，同時設置陰性對照孔。熒光定量PCR反應程序：DNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(2×)，10.0 μL，探針 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，0.2 μL；ddH2O 補至25 μL，進行PCR擴增，反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)：72℃ 8 min。檢測標準品的6個濃度梯度(102copies/μL～107copies/μL)，將不同濃度的質粒模板進行3次重復，得到相應的擴增曲線和標準曲線。根據(jù)R2值和擴增曲線判斷其重復性。取稀釋好的標準品9×103、9×102、9×101copies/μL，用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，確定該檢測方法的靈敏度。分別提取PCV2、PRRSV、PRV、CSFV的cDNA或DNA為模板進行TaqMan熒光定量PCR檢測，確定該檢測方法的特異性。

1.2.3 感染PCV2的豬PBMCs中病毒核酸載量 分別于PCV2接種PBMCs后的12、24、36、48、60、72 h收集細胞，將孔板置-80℃反復凍融3次，4℃離心20 min，收集上清。抽提病毒基因組DNA，按照建立的熒光定量PCR方法進行檢測，每個樣品做3個重復，記錄CT值，根據(jù)標準曲線計算PBMCs中PCV2的病毒載量。

1.2.4 PCV2感染豬PBMCs中PD-1、PD-L1和IL-21核酸的定量檢測 按照RNA提取試劑盒的說明書提取PCV2感染的PBMCs的RNA，進行反轉錄，反轉錄步驟如下：37℃孵育15 min，85℃水浴5 s，4℃冷卻即為cDNA。利用本實驗室建立的豬PD-1、PD-L1和IL-21的熒光定量PCR方法[9]，進行PD-1、PD-L1和IL-21的檢測。

2 結果

2.1 豬PBMCs的分離

將獲得的PBMCs在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，能夠看到細胞透亮、分散均勻，死亡細胞和細胞碎片都比較少，能夠滿足后續(xù)試驗的需要(圖1)。

圖1 健康豬外周血分離的PBMCs(200×)

2.2 PCR擴增PCV2目的基因鑒定結果

提取病毒DNA后進行普通PCR。PCR產物電泳檢測顯示，目的條帶與預期條帶大小一致，如圖2所示。產物經回收、連接、轉化后挑選獲得陽性克隆，經測序比對與預期結果一致。提取質粒后，OD260 nm/OD280 nm值均在1.8～2.0之間，單位體積中質粒的拷貝數(shù)為9×1010copies/μL。

M.DNA標準DL 2 000；1～3.PCV2的PCR產物；4.PCV2陰性對照

2.3 標準曲線的繪制

將陽性標準品1∶10倍倍比稀釋，濃度從107copies/μL～102copies/μL，建立標準曲線，如圖3和圖4所示，擴增曲線良好，直線方程為y=-3.591x+40.773。通過標準曲線可知，變異系數(shù)R2≥0.999，表明該試驗誤差較小，并且可靠、準確，可以用于目的基因的檢測。

1.9×107 copies/μL；2.9×106 copies/μL；3.9×105 copies/μL；4.9×104 copies/μL；5.9×103 copies/μL；6.9×102 copies/μL

圖4 標準品的標準曲線

2.4 方法的重復性

將不同濃度的模板做3個平行，結果見圖3，均有良好的擴增曲線，表明建立的TaqMan探針熒光定量PCR方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 方法的敏感性

將標準品以10倍倍比稀釋，取濃度分別為9×103、9×102、9×101copies/μL標準品，獲得動力學曲線，如圖5所示，標準品濃度為9×103copies/μL和 9×102copies/μL時均出現(xiàn)良好的擴增，9×101copies/μL時，擴增曲線不理想。結果表明，TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測質粒的靈敏度達到9×102copies/μL。

1.9×103 copies/μL；2.9×102 copies/μL；3.9×101 copies/μL；4.陰性對照1.9×103 copies/μL；2.9×102 copies/μL；3.9×101 copies/μL；4.Negative control

2.6 方法的特異性

對PCV2、PRV、PRRSV、CSFV所抽提的DNA或cDNA為模板和雙蒸水進行TaqMan 熒光定量PCR檢測。由圖6可知，該方法對PCV2 DNA樣品有良好的適應性，只有PCV2樣品的檢測結果有熒光產生且擴增曲線良好，對PRRSV、CSFV、PRV和無菌水檢測結果均無熒光產生，證明該方法在病毒樣品PCV2的檢測中有很好的特異性。

1.PCV2；2.陰性對照；3.狂犬病病毒；4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒；5.豬瘟病毒1.PCV2；2.Negative control；3.PRV；4.PRRSV；5.CSFV

2.7 豬PBMCs PCV2病毒核酸載量

PCV2感染豬PBMCs后，分別在12、24、36、48、60、72 h收集細胞，提取病毒DNA，利用建立的TaqMan熒光定量PCR方法檢測PCV2的病毒載量，獲得其不同時間點在細胞中的增殖。結果顯示，PCV2在PBMCs中隨著時間的延長，病毒載量逐漸升高，一直持續(xù)到72 h，說明PCV2能在體外感染PBMCs進行增殖，結果如圖7所示。

圖7 PCV2感染PBMCs過程中的病毒載量變化

2.8 熒光定量PCR檢測PCV2感染豬PBMCs中PD-1、PD-L1和IL-21的轉錄變化

當PBMCs體外被PCV2感染后，分別于12、24、36、48、60、72 h收取細胞，提其RNA并反轉錄成cDNA，然后進行熒光定量PCR擴增。結果顯示，PD-1和PD-L1都轉錄上調，PD-1在60 h～72 h上調最明顯，在72 h時達到峰值(P<0.01)；PD-L1在12 h～72 h表達上調很明顯(P<0.01)，并且轉錄水平都高于PD-1，如圖8所示。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)“* ”indicates significant differences (P<0.05),“**” indicates extremely significant differences (P<0.01)

PCV2體外感染PBMCs后，每間隔12 h收集細胞樣品直至72 h。利用RNA抽提試劑盒提取其RNA，并反轉錄成cDNA，然后進行熒光定量PCR擴增。結果顯示，IL-21明顯轉錄上調，并且在12 h～24 h和60 h～72 h上調最明顯(P<0.01)，60 h時達到峰值，結果如圖9所示。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論

PCV2作為一種重要的動物免疫抑制性疾病病原，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經濟損失[10]。目前，PCV2主要依靠各種疫苗進行預防，減少經濟損失[11-12]。此外，PCV2致病機制的研究集中在與免疫相關的細胞因子分泌變化的調節(jié)機制。研究表明，PCV2感染過程中，PD-1、PD-L1的轉錄水平上升，導致正向免疫調節(jié)的細胞因子IL-2和IFN-γ的轉錄水平降低，PBMCs增殖能力顯著降低[1]。IL-21屬于IL-2家族的成員，與 IL-2 結構類似，主要由活化的CD4+T細胞和NK細胞分泌產生。由于其受體表達于多種免疫細胞(B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)表面，在先天性和適應性免疫應答中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用，尤其在機體的細胞免疫和體液免疫方面發(fā)揮著至關重要的作用[13]。體外培養(yǎng)艾滋病病毒患者的PBMCs發(fā)現(xiàn)IL-21能夠增加CD8+T細胞的毒性作用，抵抗艾滋病病毒的感染。因此，IL-21對調節(jié)機體的免疫和清除病毒感染至關重要。然而，關于PCV2感染和IL-21表達水平之間的研究還鮮有報道，目前只有對FMDV和PRRSV感染后的研究，發(fā)現(xiàn)IL-21能夠提高機體的抗體水平發(fā)揮抗病毒作用[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，與IL-21相關的IL-17A轉錄水平升高[5]。據(jù)此，推測PCV2感染過程中IL-21的轉錄水平也升高。因此，為了研究PCV2感染過程中IL-21的轉錄水平變化，利用PCV2體外感染PBMCs，建立PCV2的病毒載量的檢測方法，分析PCV2在PBMCs增殖后對IL-21轉錄水平的影響。

PCV2感染后IL-6的表達水平上升，并通過與其受體結合，活化信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)，導致IL-17和IL-21的轉錄水平上升[13]，而IL-21又可以直接增加T細胞上PD-1的表達[14]，從而降低IL-21的抗腫瘤作用[15]。相關研究表明，磷酸化的STAT3和PD-1共同促進IL-17的表達。因此，STAT3可能在IL-21和PD-1、PD-L1的表達調控中發(fā)揮著重要的作用。同時，查閱文獻也發(fā)現(xiàn)，IL-21也是PD-L1和PD-L2的刺激物[16]，IL-21升高促進PD-L1的表達，這在研究結果中也有體現(xiàn)。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，PCV2感染后IL-21的轉錄水平升高，進一步促進了PD-L1的轉錄水平上升，在48h達到峰值。但是還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1通路激活后，IL-21的轉錄水平反而下降，并且在48h達到最低值，比正常細胞還要低。這也體現(xiàn)在自然感染PCV2時，隨著時間延長，PD-L1轉錄水平上升，正向免疫調節(jié)的細胞因子IL-2、IFN-γ等轉錄水平降低[4]。因此，PCV2體外感染PBMCs時，隨著病毒載量的增加，PD-L1和IL-21的轉錄水平增高，這與預期的試驗結果相一致。

隨著PD-1、PD-L1的轉錄水平增高，抑制了IL-21的轉錄水平，通過熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，在PCV2感染后60 h時IL-21的轉錄水平達到峰值，一直持續(xù)到72 h仍然顯著增高；同時，PD-1、PD-L1的轉錄水平也增高，但是轉錄水平低于IL-21。由于IL-21通過STAT3磷酸化提高PD-1的表達水平[14,17]，引起病毒感染。另外，IL-21也能夠提高PD-L1和PD-L2的表達水平，激活PD-1/PD-Ls通路，導致機體發(fā)生免疫抑制。

綜上所述，PCV2在體外感染PBMCs時，隨著病毒載量的增加導致PD-1、PD-L1和IL-21的轉錄水平上升，但是由于PD-1和PD-L1轉錄水平升高又反過來抑制了IL-21的轉錄；機體為了清除病毒，調動免疫系統(tǒng)產生更多的IL-21。但是，PCV2感染過程中PD-1、PD-L1與IL-21之間的相互作用機制還不清楚。又由于IL-21能夠通過提高STAT3磷酸化提高PD-1的表達[14]，因此推測STAT3可能在PD-1、PD-L1和IL-21之間的相互調控中發(fā)揮重要作用。本文為進一步研究PD-1、PD-L1和IL-21的之間的相互調控機制奠定了理論基礎，也為后期阻斷PD-1/PD-L1控制PCV2感染提供新的途徑。