郭麗民，席進(jìn)孝，葛亞俊，王宇萌，苗克軍，吳 斌，徐大琴

鼠疫是一種流行在嚙齒動(dòng)物間通過蚤傳播的自然疫源性疾病，病原體為鼠疫耶爾森菌。鼠疫菌對(duì)糖、醇的酵解能力是生化分型的重要指標(biāo)之一。紀(jì)樹立等[1]根據(jù)鼠疫菌生物學(xué)特征，將我國(guó)不同類型鼠疫疫源地分離的鼠疫菌株分為17個(gè)生態(tài)型。段永明等[2]將甘肅省鼠疫疫源地分離的菌株分為阿爾金型、青藏型、祁連型和甘寧黃鼠型。不同生態(tài)型的鼠疫菌均占有一塊各自相對(duì)獨(dú)立的疫源地分布區(qū)，而且菌株在分布區(qū)內(nèi)占有優(yōu)勢(shì)。各疫源地動(dòng)物間鼠疫流行強(qiáng)度的差異，使得菌株在適應(yīng)環(huán)境的變化過程中遺傳特征發(fā)生變化，這種變異被保存下來，造成不同疫源地間菌株在基因上的差異。由于甘肅省動(dòng)物間鼠疫流行猛烈，常波及人間鼠疫疫情流行，而且非法獵捕販運(yùn)旱獺容易造成鼠疫遠(yuǎn)距離傳播，為此需要利用簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的分子分型方法對(duì)鼠疫疫情進(jìn)行溯源分析。VNTR在鼠疫菌基因組中分布廣泛，可以通過分析多個(gè)位點(diǎn)的變異信息，進(jìn)行鼠疫菌基因分型和進(jìn)化分析，即MLVA(Multiple locus variable number tandem repeat analysis)方法。本實(shí)驗(yàn)室早期利用15個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行鼠疫菌株的基因分型，只將鼠疫菌株分為兩個(gè)群，不能區(qū)分不同生化型的鼠疫菌株[3]。本次研究采用MLVA(14+12)分級(jí)分型的方法對(duì)甘肅省鼠疫菌株進(jìn)行基因分型[4]，以期建立甘肅省鼠疫菌VNTR位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)，為鼠疫疫情的鑒定溯源提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及DNA制備 選取甘肅省1962-2014年間198株鼠疫菌，其中甘寧黃鼠型菌株6株、青藏型菌株128株、祁連型菌株46株、阿爾金型菌株18株。菌株保藏于甘肅省疾病預(yù)防控制中心鼠疫防制科。鼠疫菌DNA提取參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，置-20 ℃保存。

1.2 儀器及試劑 PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，3730(美國(guó)ABI公司)，5415D小型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，水平電泳儀(北京六一儀器廠)。PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DL1000(寶生物有限公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，低分子量Markers和500liz、1200liz內(nèi)標(biāo)marker(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 引物 采用14+12對(duì)VNTR引物[4,6]，引物信息見表1。

表1 14+12對(duì)MLVA引物序列信息

1.3.2 PCR反應(yīng)體系及條件 反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，最適退火溫度1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。引物為M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、M25、M23 時(shí)，退火溫度為60 ℃，引物為MS09、N2486、MS73、MS41、M34、M33、M22、M43、M28、M29時(shí)，退火溫度為55 ℃，引物為N3779、N2896、N0865、N2976、N1606、N2577、N3773、N2117體系的退火溫度為52 ℃ 1 min。

1.3.3 水平瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL 6×loading buffer混合后，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析有無產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增、核對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

1.3.4 PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)的確定 將PCR產(chǎn)物送專業(yè)技術(shù)服務(wù)公司(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)分子量大小確定各個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)。

1.3.5 聚類分析 統(tǒng)計(jì)菌株各個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)，采用BioNumerics5.10軟件，采用效用均等的分類資料分析方法對(duì)各對(duì)引物的拷貝數(shù)進(jìn)行聚類分析。為加強(qiáng)MLVA分型方法中14個(gè)低變異度指標(biāo)在鼠疫種群中的區(qū)分能力，減弱高變異度的12個(gè)指標(biāo)對(duì)聚類關(guān)系的影響，將第一級(jí)分型14個(gè)指標(biāo)的權(quán)重設(shè)為2，用于種內(nèi)溯源分析的12個(gè)指標(biāo)權(quán)重設(shè)為1[7]。甘肅省1∶25萬矢量化鎮(zhèn)(鄉(xiāng))地圖由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。采用ArcGIS10.3軟件進(jìn)行鼠疫菌MLVA類群地區(qū)分布特征分析。

2 結(jié) 果

2.1 甘肅省鼠疫菌VNTR拷貝數(shù)結(jié)果 “14+12”個(gè)VNTR位點(diǎn)在甘肅省鼠疫菌基因組中拷貝數(shù)的結(jié)果見表2。與已完成全基因組測(cè)序的東方型鼠疫菌株CO92的VNTR位點(diǎn)拷貝數(shù)比較，26個(gè)VNTR位點(diǎn)均表現(xiàn)出不同于CO92的拷貝數(shù)。引物M34拷貝數(shù)變化類型最多，為17種，而最少的拷貝數(shù)變化類型為2種，說明26對(duì)引物的分辨能力高，能將甘肅省鼠疫菌株分為不同的基因型。

表2 14+12個(gè)VNTR位點(diǎn)在甘肅省鼠疫菌株基因組中的拷貝數(shù)變化類型

2.2 甘肅省鼠疫菌MLVA基因型及地區(qū)分布 “14+12”個(gè)VNTR位點(diǎn)將198株鼠疫菌分成1-127型，基因分型比較復(fù)雜。阿拉善黃鼠疫源地(會(huì)寧縣和平川區(qū))MLVA基因型有122、124-127型；甘南高原疫源地(夏河縣)MLVA基因型有39-43型；阿爾金山鼠疫源地(阿克塞縣)MLVA基因型有89-115型；大雪山鼠疫疫源地(肅北縣和玉門市)有44-68型、69-88型、116-119型，祁連山北麓鼠疫源地(肅南縣)MLVA基因型有1-38型。見表3。

表3 甘肅省鼠疫菌MLVA類群及地區(qū)分布

2.3 甘肅省鼠疫菌VNTR聚類圖 采用“14+12”個(gè)VNTR位點(diǎn)分析中，將14個(gè)低變異度指標(biāo)權(quán)重設(shè)為2，另外12個(gè)指標(biāo)權(quán)重設(shè)為1。聚類結(jié)果顯示，198株鼠疫菌分為10個(gè)群，對(duì)比菌株的分離地點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，大部分菌株根據(jù)分離地點(diǎn)聚集成為一群，每個(gè)群中菌株可繼續(xù)分為5-28個(gè)不同分支。通過聚類圖可以看出，阿拉善黃鼠疫源地菌株全部聚集為一群。阿克塞縣鼠疫菌株主要分為2個(gè)群，分別集中在阿克塞縣紅柳灣鎮(zhèn)當(dāng)金山群(35/47)和加爾烏宗村群(10/47)。肅北縣鼠疫菌主要分為3個(gè)群，分別為黨城灣鎮(zhèn)馬場(chǎng)群(6/57)、黨城灣鎮(zhèn)群(25/58)和魚兒紅群(21/57)。玉門市菌株(5/6)主要聚集在肅北縣魚兒紅群內(nèi)。夏河縣菌株單獨(dú)成為一群。肅南縣菌株主要分為3個(gè)群，分別為大河鄉(xiāng)群(14/73)、馬蹄鄉(xiāng)群(33/73)和康樂鄉(xiāng)群(6/73)。見圖1和圖2。

圖1 198株甘肅省鼠疫菌VNTR位點(diǎn)拷貝數(shù)聚類圖

注：甘肅省1∶25萬矢量化鎮(zhèn)(鄉(xiāng))地圖由中國(guó)CDC提供。由于地圖中無法標(biāo)注加爾烏宗村和馬場(chǎng)村，分別在相應(yīng)的城鎮(zhèn)地圖中按照村的具體位置選取一定區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注。

3 討 論

MLVA方法廣泛應(yīng)用于鼠疫菌基因分型，但是VNTR位點(diǎn)選擇的不同對(duì)分子分型和聚類的結(jié)果存在一定差別。Pourcel等[8]人選用25個(gè)位點(diǎn)將180株鼠疫菌分成61個(gè)基因組型，而且3個(gè)生物型分別位于3個(gè)主要分支上，并發(fā)現(xiàn)中世紀(jì)型菌株存在一定的多態(tài)性。Klevytska等[9]采用46個(gè)位點(diǎn)對(duì)94株鼠疫菌進(jìn)行分型，正確反映了古典型、中世紀(jì)型、東方型和田鼠型菌株之間的進(jìn)化關(guān)系。Li等[4]從88個(gè)鼠疫菌VNTR位點(diǎn)篩選出“14+12”個(gè)位點(diǎn)用于快速溯源分析，提高了基因分型的分辨率，縮短實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的時(shí)間和成本。本實(shí)驗(yàn)采用的26個(gè)位點(diǎn)能夠?qū)⑸鷳B(tài)型不同的鼠疫菌區(qū)分開，并呈現(xiàn)明顯的區(qū)域聚集性特征。

甘肅省鼠疫菌MLVA基因分型與生態(tài)型能夠很好的吻合，并且基因分型能夠繼續(xù)細(xì)分，精確到每個(gè)菌株的分離地點(diǎn)。會(huì)寧縣和平川區(qū)阿拉善黃鼠疫源地為甘寧黃土高原阿拉善黃鼠疫源地的西南部分，景觀為低山丘陵干草原，菌株為甘寧黃鼠型，菌株獨(dú)自成為一群。甘南高原疫源地的夏河縣和祁連山北麓東段區(qū)的肅南縣均為旱獺疫源地，景觀均為森林高山草甸草原。夏河縣菌株為青藏型，肅南縣菌株為祁連型。夏河縣菌株聚集成為一群后，與肅南縣菌株聚集在一起，肅南縣菌株根據(jù)分離地點(diǎn)繼續(xù)分為3個(gè)群，每群間菌株沒有明顯的地理屏障，菌株VNTR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)有細(xì)微差別，每個(gè)群內(nèi)菌株繼續(xù)分化，表明MLVA分型方法分辨率極高，可用于觀察菌株的微遺傳進(jìn)化。阿爾金山疫源地的阿克塞縣和大雪山疫源地的肅北縣為旱獺疫源地，景觀類型為高山草原。阿克塞縣菌株主要為阿爾金型，肅北縣菌株主要為青藏型。阿克塞縣菌株分成2個(gè)群，是當(dāng)金山群和祁連山西段分離的菌株聚集成的加爾烏宗村群，兩群菌株之間地理上接壤，沒有明顯的地理屏障。加爾烏宗村群與肅北縣黨城灣鎮(zhèn)馬場(chǎng)群的菌株聚集成為大群，兩地地理上接壤，沒有明顯的地理屏障，屬于祁連山西段，菌株之間交流頻繁，適應(yīng)相應(yīng)的地理環(huán)境成為優(yōu)勢(shì)菌株。肅北縣的鼠疫菌除馬場(chǎng)群外，還存在黨城灣鎮(zhèn)群和魚兒紅群。黨城灣鎮(zhèn)群和魚兒紅群菌株VNTR位點(diǎn)不同，黨城灣鎮(zhèn)和魚兒紅之間存在大雪山地理屏障，使兩地菌株成為兩個(gè)群。玉門市鼠疫疫源地及毗鄰的肅南縣祁豐鄉(xiāng)生境特征與肅北縣魚兒紅相同，且地理位置接壤，屬于同塊疫源地，故菌株都聚集為一群。

甘肅省鼠疫菌遺傳特征復(fù)雜，采用MLVA分型方法發(fā)現(xiàn)肅南縣康樂鄉(xiāng)、馬蹄鄉(xiāng)和大河鄉(xiāng)群內(nèi)均含有肅北縣菌株，而肅北縣黨城灣鎮(zhèn)、魚兒紅內(nèi)含有肅南縣菌株，肅北縣黨城灣鎮(zhèn)馬場(chǎng)群內(nèi)含有阿克塞縣菌株。這種群內(nèi)菌株交叉存在的結(jié)果與DFR、CRISPR分型方法結(jié)果一致[10-12]。不同群內(nèi)菌株的交叉存在，表明阿爾金山-祁連山北麓東段疫源地鼠疫菌基因組之間存在交流，究其原因有待進(jìn)一步研究。鼠疫菌VNTR位點(diǎn)拷貝數(shù)不斷變化，菌株在自然選擇壓力作用下適應(yīng)不同生態(tài)景觀成為某地區(qū)的主要基因類群，從而肅北縣和肅南縣疫源地菌株存在主要基因類群和次要基因類群。不同基因類群鼠疫菌的存在表明鼠疫在動(dòng)物間持續(xù)流行。相對(duì)應(yīng)處于肅北縣與阿克塞縣接壤地區(qū)的馬場(chǎng)，肅北縣和肅南縣接壤地區(qū)的祁豐鄉(xiāng)出現(xiàn)主次基因類群和不同生態(tài)型菌株交叉共存，出現(xiàn)菌株移行重疊現(xiàn)象，更例證了研究中發(fā)現(xiàn)群內(nèi)菌株交叉存在的現(xiàn)象。同種疫源地出現(xiàn)不同類型的鼠疫菌，使得菌株溯源復(fù)雜多樣，尤其是在人間鼠疫疫情追蹤溯源時(shí)要予以重視。

MLVA 作為一種分子分型方法，其具有高分辨率，可操作性強(qiáng)，費(fèi)用較低，適合推廣應(yīng)用。本次采用MLVA(14+12)方法對(duì)198株甘肅省鼠疫菌進(jìn)行基因分型，獲得準(zhǔn)確的鼠疫菌VNTR位點(diǎn)拷貝數(shù)本底資料，為今后鼠疫菌株的追蹤溯源提供技術(shù)資料，為研究甘肅省鼠疫疫源地鼠疫菌遺傳進(jìn)化規(guī)律奠定基礎(chǔ)，也為今后開展鼠疫菌遺傳突變的監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

利益沖突：無