林家鋒，陶曉莉，陸恒章，于美玲，李婷婷，李藤菲，程美慧，李永剛

輪狀病毒(Rotavirus, RV)是能夠使人類和動物引起一系列消化系統(tǒng)癥狀的常見病毒，可侵及小腸黏膜并且附著定居，給宿主細胞造成極大的危害[1]。與其他RNA病毒相比，它參與編碼6種結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)及6種非結構蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6)，對病毒的增殖及致病有著重要的生物學意義[2-4]。RV大多通過糞-口途徑傳播，秋冬季節(jié)活躍，在一般環(huán)境中能穩(wěn)定生存。它在世界范圍內(nèi)廣泛存在，分型眾多，A～C組能夠?qū)е氯祟惡蛣游锔篂a，D～G組只能導致動物腹瀉，給當?shù)丶倚髽I(yè)及衛(wèi)生健康構成極大的威脅[5-6]。一經(jīng)感染，便可誘發(fā)蛋花湯樣便、眩暈、發(fā)熱等具體表現(xiàn)，嚴重者會因機體內(nèi)環(huán)境失衡而脫水、休克死亡[7]。然而，目前尚無治療該病毒公認有效的藥品或疫苗，此外該病毒與宿主間的互作機制和致病機理還有待進一步研究。

作為一種重要的非結構蛋白，NSP5具有高度磷酸化的功能，能在細胞質(zhì)內(nèi)表達且穩(wěn)定調(diào)控病毒的復制和感染周期。研究表明，具有多個骨架蛋白修飾位點的NSP5可與NSP2、VP2以及VP6蛋白共同構成病毒質(zhì)體，而病毒質(zhì)體又是病毒復制的主要場所[8-10]。一些學者通過小干擾RNA7(MicroRNA-7)靶向下調(diào)NSP5的表達，從而影響病毒質(zhì)體的形成并抑制RV復制[11]。由此可見，NSP5在病毒的增殖表達及生物學活性中發(fā)揮著重要的作用，但具體機制還不清楚，本研究利用分子克隆的方法構建A組RV-NSP5重組表達載體來檢測其在細胞內(nèi)的表達，并對原核表達的條件進行優(yōu)化分析，確定融合蛋白的富集位置，從而進一步探究分離株RV NSP5在病毒增殖中所承擔的作用，同時為后續(xù)多抗及相關制劑的制備提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 病毒、細胞與質(zhì)粒 本實驗所用的A組RV病毒株分離自遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院一患兒糞便樣品，293T細胞購于北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心，pGEX-6P-1原核表達載體和pFLAG-CMV-3真核表達載體由錦州醫(yī)科大學病原生物學實驗室保存。

1.1.2 試劑 KOD-PLus-Neo PCR擴增試劑盒購買于日本TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶、XhoⅠ酶、XbaⅠ酶、DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購買于大連TaKaRa公司；TRIzol Reagent LS購買于Ambion公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA中提試劑盒都購買于美國Axyprep公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購買于北京天根生化科技有限公司；DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、氨芐西林鈉(Ampicilin，Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)、酵母提取物、胰蛋白胨都購買于北京索來寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清都購買于Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購買于碧云天生物技術公司；GST瓊脂糖純化樹脂購買于上海生工公司；抗FLAG單克隆抗體購買于Sigma公司；Mouse Anti-β-actin mAb和Mouse Anti-GST mAb購買于北京中杉金橋生物技術有限公司；Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG(H+L)和HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)都購買于美國Invitrogen公司等。

1.2 NSP5原核及真核表達載體的構建

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)分離所得的病毒株進行引物設計并經(jīng)BLAST檢測特異性、測序檢測準確性。詳見表1。

表1 輪狀病毒NSP5原核及真核表達引物

1.2.2 提取RV RNA及PCR擴增NSP5 從RV病毒分離株提取RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、PCR反應獲得特異NSP5基因。反應體系及成分為：KOD-PLus-Neo酶1 μL，cDNA 1 μL，dNTP 5 μL，MgSO43 μL，10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，最后用ddH2O補足至50 μL；條件如下：94 ℃持續(xù)2 min; 98 ℃持續(xù)10 s，58 ℃持續(xù)30 s，68 ℃持續(xù)30 s，共35個循環(huán);最后 68 ℃ 持續(xù)7 min。電泳后，將NSP5目的條帶切膠并且純化回收，測序驗證。

1.2.3 NSP5-pGEX-6P-1和NSP5-pFLAG-CMV-3的構建和鑒定 對純化的NSP5片段和空載體雙酶切，酶切反應體系分別為pGEX-6P-1或NSP5 2.5 μg，EcoR I 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×H Buffer 5 μL，ddH2O補足至50 μL；pFLAG-CMV-3或NSP5 2.5 μg，EcoR I 1 μL，XbaⅠ 1 μL，10×M Buffer 5 μL，0.1% BSA 5 μL，ddH2O補足至50 μL，條件為37 ℃水浴3 h。DNA液體純化再回收，經(jīng)電泳驗證和理論大小相符時，把載體片段以及目的片段按1∶5比例、總體積10 μL進行連接，連接酶10 μL，16 ℃反應1 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，第2 d選細菌培養(yǎng)板上生長狀況良好的單克隆菌落，進行菌落PCR的初步驗證。驗證陽性者，即可中提質(zhì)粒，雙酶切驗證。所得質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序驗證。

1.3 NSP5-pFLAG-CMV-3真核細胞轉(zhuǎn)染及相關檢測

1.3.1 293T細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T細胞按照每孔6×105的數(shù)量級加到6孔板中，培養(yǎng)過夜。等長到60%～70%的時候，每個孔240 μL Opti-MEM稀釋10 μL PEI，輕柔混合切勿振蕩，室溫孵育5 min；然后240 μL Opti-MEM稀釋4 μg NSP5-pFLAG-CMV-3重組質(zhì)粒，用同樣的方法稀釋pFLAG-CMV-3空載體。把上述稀釋液分別緩慢混合，室溫孵育20 min。最后，加入對應孔培養(yǎng)細胞48 h，用于Western Blot和間接免疫熒光檢測。

1.3.2 Western blot檢測 NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染后，吸棄上清液體，每個孔加入250 μL的NP-40，變性、離心、-20 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)過10%SDS-PAGE分離，15V半干轉(zhuǎn)12 min，PVDF膜右上角裁角標記，5% 脫脂奶粉封閉2.5 h。然后，用封閉液1∶2 000稀釋鼠抗β-actin抗體、1∶5 000的比例稀釋鼠抗FLAG抗體，浸沒PVDF膜4 ℃過夜。1×PBST洗膜10 min×3次；二抗HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)經(jīng)1∶3 000稀釋后將膜均勻孵育，室溫1 h，洗膜10 min×3次。ECL顯影拍照，檢測NSP5-pFLAG-CMV-3蛋白在細胞水平上的表達。

1.3.3 間接免疫熒光檢測 取出細胞培養(yǎng)板置于室溫下，棄掉原有培養(yǎng)液，4%多聚甲醛靜置1 h，500 μL PBS洗滌3次，加200 μL 0.1% Triton X-100靜置15 min，500 μL PBS洗滌3次。1% BSA靜置1 h，PBS洗后，加1∶200比例稀釋的鼠抗FLAG，37 ℃孵箱中靜置1 h。吸掉一抗，500 μL PBS洗滌3次，避光環(huán)境下加入1∶500比例稀釋的羊抗鼠熒光二抗，37 ℃濕盒避光1 h，吸掉二抗，PBS洗滌后，運用熒光顯微鏡采圖。

1.4 NSP5-pGEX-6P-1原核表達和條件優(yōu)化

1.4.1 NSP5-pGEX-6P-1在大腸桿菌中的原核表達 NSP5-pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，置在細菌培養(yǎng)箱生長過夜。第二天把重組菌的單菌落接種至150 mL新鮮的LB培養(yǎng)液(1∶1 000的比例加了Amp)，在恒溫搖床培養(yǎng)，直至重組菌菌體OD值達到0.6～0.8時，設置不同變量對最適蛋白誘導表達條件進行摸索：IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)、誘導溫度(28 ℃和37 ℃)以及誘導時間(2、4、6、8、10、12 h)。

1.4.2 NSP5-pGEX-6P-1可溶性表達、純化及鑒定 取出保存的最佳誘導條件下菌體蛋白，冰浴超聲破碎：每次工作5 s、間歇10 s，總共超聲99次。然后，離心，保存上清，冰浴條件下用400 μL PBS將沉淀吹打均勻。各吸50 μL上清及沉淀，變性、離心后制成樣品，進行后續(xù)SDS-PAGE分析。經(jīng)大量誘導表達后，沉淀蛋白用含鹽酸胍的變性緩沖液充分溶解，4 ℃搖晃過夜。次日，不斷用不含鹽酸胍的復性緩沖液超濾置換，直至液體清透。根據(jù)GST瓊脂糖純化樹脂說明書，控制流速上柱洗脫，并測定純化所得目的蛋白的濃度。隨后，將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Mouse Anti-GST mAb為一抗、HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)為二抗，分別以1∶2 000和1∶3 000稀釋，進行Western Blot檢測。

2 結 果

2.1 RV-NSP5基因擴增 RV cDNA經(jīng)針對NSP5的特異引物進行體外擴增，電泳結果表明，605 bp左右出現(xiàn)一明亮條帶，與預期片段大小一致(圖1)。測序結果進一步表明，RV-NSP5基因擴增成功。

1為RV-NSP5目的片段

2.2 重組載體的構建及鑒定 擴增反應產(chǎn)物經(jīng)過DNA膠回收純化、酶切、再純化及片段連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取質(zhì)粒后分別使用EcoRI/XhoI和EcoRI/XbaⅠ進行雙酶切驗證，得到的條帶與理論大小相符(圖2、3)。經(jīng)測序結果證明，所得序列與NSP5基因序列相一致，表明NSP5-pGEX-6P-1和NSP5-pFLAG-CMV-3重組質(zhì)粒構建成功(圖4、5)。

1為NSP5-pGEX-6P-1質(zhì)粒

1為NSP5-pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

圖4 NSP5-pGEX-6P-1的測序鑒定圖(部分截圖)

圖5 NSP5-pFLAG-CMV-3的測序鑒定圖(部分截圖)

2.3 Western blot 驗證NSP5-pFLAG-CMV-3在細胞中的表達 NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染至293T細胞，分析NSP5在細胞水平上的表達情況。由圖所示，NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染后在約25 kD呈現(xiàn)特異條帶，符合理論大小，而pFLAG-CMV-3空載體轉(zhuǎn)染并沒有出現(xiàn)條帶(圖6)。

1為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-3質(zhì)粒；2為轉(zhuǎn)染NSP5-pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

2.4 間接免疫熒光檢測NSP5-pFLAG-CMV-3在細胞內(nèi)分布 NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染至293T細胞之后在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，IFA結果表明，轉(zhuǎn)染NSP5-pFLAG-CMV-3的細胞能夠觀察到熒光主要匯集在細胞質(zhì)中，細胞核并沒有熒光；轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-3空載體沒有呈現(xiàn)出特異性熒光(圖7)。

A為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒NSP5-pFLAG-CMV-3；B為轉(zhuǎn)染空載體pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

2.5 NSP5-pGEX-6P-1優(yōu)化表達、純化及鑒定 經(jīng)誘導條件摸索，確定NSP5-pGEX-6P-1最適誘導條件為37 ℃、8 h、IPTG 0.4 mmol/L，超聲破碎獲得上清液和沉淀懸液，用于電泳及進一步的染色分析。結果表明，在最適蛋白誘導條件下，NSP5-pGEX-6P-1大部分是以包涵體形式富集于沉淀中表達，而在上清的可溶性表達微乎其微(圖8A)。包涵體蛋白在變性、復性之后，經(jīng)GST瓊脂糖樹脂親和層析洗脫，純化所得的蛋白濃度為0.92 mg/mL(圖8B)。經(jīng)Western Blot檢測，純化的融合蛋白能被抗GST單抗特異性識別，且在48 kD左右處有一條特異性條帶，符合預期大小(圖8C)。

A：NSP5-pGEX-6P-1菌體總蛋白裂解后分析：1為裂解后的上清液；2為裂解后的沉淀懸液；B：NSP5-pGEX-6P-1純化蛋白SDS-PAGE分析：1和2為純化所得的重組蛋白；C：NSP5-pGEX-6P-1純化蛋白的Western Blot檢測：1為純化所得的重組蛋白

3 討 論

輪狀病毒是全球高發(fā)的人獸共患病原體之一，約95%的嬰幼兒在5歲前受過感染，此外也給畜牧業(yè)和世界經(jīng)濟造成了一定的損失[12]。由于該種病毒包裝機制復雜，復制增殖功能會大大加強病毒的致病力，給衛(wèi)生防控帶來了很大的難度[13]。至今除了預防性減毒活疫苗外，尚無有效的藥物及制劑可治療輪狀病毒，故從輪狀病毒的基因成分入手，對病毒的致病機制、表達方式及與宿主間互作機理進行深入研究，從而為腸道類病毒的檢測和治療提供理論基礎。

NSP5是病毒基因組11片段編碼的蛋白質(zhì)，含有大量絲氨酸、蘇氨酸等多種氨基酸的修飾位點，參與RV翻譯后修飾及加工處理，對病毒的復制周期和蛋白表達調(diào)控有著舉足輕重的作用[14]?；诜聪蜻z傳學技術的興起，科學家嘗試產(chǎn)生NSP5的穩(wěn)定反向互補系統(tǒng)以鑒定NSP5突變對RV病毒株的影響，結果發(fā)現(xiàn)NSP5過度磷酸化是裝配圓形病毒質(zhì)體的關鍵步驟，并且突出了NSP5的C末端尾巴在具有復制能力的病毒工廠形成過程中的關鍵作用[15-18]。隨后，Buttafuoco等[19]發(fā)現(xiàn)NSP5高表達是一個初始步驟，能夠觸發(fā)與NSP2、VP2結合形成胞質(zhì)包涵體，可在病毒顆粒蛋白募集過程中起到“橋梁”作用，這便為蛋白互作影響病毒功能提供了有力的依據(jù)。由此表明，NSP5非結構蛋白在病毒的復制和表達過程中起到非常重要作用，所以NSP5是如何加快病毒感染宿主并且協(xié)助逃避免疫監(jiān)視將會是人類未來深入探討的一大課題。

本次研究通過構建輪狀病毒NSP5真核及原核表達系統(tǒng)，一方面通過轉(zhuǎn)染真核細胞來研究重組質(zhì)粒在細胞水平上的表達情況，為深入探究NSP5的功能與致病機理提供了新思路；另一方面，基于重組蛋白獨特的屬性，利用基因工程等方面的技術，摸索出最優(yōu)化的表達條件，確定了重組蛋白富集在沉淀中，恰恰也驗證了Buttafuoco等研究者的觀點，并且順利純化NSP5蛋白，這為研制多抗提供了一定的前期基礎。

利益沖突：無