閆 涵，范文來，徐 巖

（教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

釀酒原料是決定白酒產(chǎn)量和質量的物質基礎，不同品種的原料賦予酒體不同的風格[1]。在微生物的作用下，原料中的基質組分經(jīng)過發(fā)酵會產(chǎn)生多種風味物質。此外，原料本身具有的微量成分也會對酒體風味產(chǎn)生重要影響[2-3]。通常情況下，使用單一原料釀酒（單糧型白酒）時，原料多采用高粱或大米（米香型等）；使用多種糧食釀酒（多糧型白酒）時，大部分以高粱為主，并輔以大米、小麥、糯米、玉米等原料[4]。由于原料品種及配比的差異，單、多糧型白酒具有不同的風味特征[5]。

目前，關于不同原料釀造白酒的差異性研究多集中于微生物代謝[6-7]、生產(chǎn)工藝[8]和原酒風味成分[9-11]等方面，而針對白酒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的研究較少。鑒于此，本研究通過跟蹤單糧和多糧釀造的馥合香型白酒（兼具濃香、醬香和芝麻香）在發(fā)酵過程中酒醅的揮發(fā)性成分變化，比較不同原料釀造的白酒酒醅在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分生成量的差異，采用化學計量學方法，找出關鍵差異化合物，確定不同原料對白酒發(fā)酵過程的影響，為白酒生產(chǎn)過程的品質調控提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以單糧或多糧為原料生產(chǎn)的馥合香型酒醅由安徽金種子酒業(yè)股份有限公司提供。馥合香型酒醅堆積發(fā)酵期3 d，入池發(fā)酵期60 d，分別取堆積發(fā)酵第0、1、2、3天和入池發(fā)酵第1、5、10、15、20、30、40、50、60天的樣品。酒醅取樣時，選取4 個實驗窖池，同一發(fā)酵車間正常發(fā)酵的4 個窖池作為平行對照。分別取窖池上、中、下層中心處的酒醅，等量混合均勻，封口袋密封保存后于-20 ℃冷凍保藏。

氫氧化鈉、無水葡萄糖、濃鹽酸、五水硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、無水乙醚、無水氯化鈣、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、內標丙酸辛酯、叔戊酸和86 種化合物標準品（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

GC 6890N-MSD 5975氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-FFAP柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；自動進樣器（MPS2） 德國Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃?。╤ead space-solid phase microextraction，HS-SPME）萃取頭美國Supelco公司；Organomation N-EVAP氮吹儀美國Organomation公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 德國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中淀粉和還原糖的測定

參考T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》[12]，對酒醅中淀粉和還原糖進行檢測。

1.3.2 HS-SPME結合GC-MS測定揮發(fā)性化合物

參考高文俊[13]的方法，稱取10 g酒醅樣品，加入1%無水CaCl2和20 mL煮沸過的超純水混勻，于4 ℃冰箱內浸泡過夜。冰水浴超聲30 min，在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液。

吸取8 mL上清液置于20 mL頂空瓶中，加3 g NaCl和內標丙酸辛酯（終質量濃度86.68 μg/L），密封后進行HS-SPME-GC-MS分析[13]。

標準曲線：配制不同質量濃度梯度各化合物的標準液，取每個梯度標準液8 mL進行HS-SPME-GC-MS分析。采用選擇離子法，以待測物與內標峰面積之比為橫坐標，質量濃度之比為縱坐標分別繪制標準曲線。

1.3.3 液液微萃?。╨iquid-liquid microextraction，LLME）結合GC-MS定量揮發(fā)性酸類化合物

由于HS-SPME方法中使用的三相萃取頭對強極性揮發(fā)性脂肪酸類化合物的萃取效果不佳，所以采用LLMEGC-MS測定揮發(fā)性酸類化合物[14]。酒醅的預處理方法與1.3.2節(jié)相同。

吸取18 mL上清液，加入6 g NaCl、內標叔戊酸（終質量濃度3 406 μg/L）和1.5 mL重蒸乙醚，振蕩萃取3 min，靜置分層后吸取上層有機相于2 mL離心管中，于4 ℃、12 000 r/min離心3 min去乳化。吸取1 mL有機相于2 mL氣相小瓶中，氮吹濃縮至250 μL。取1 μL進行GC-MS分析。GC-MS分析條件與1.3.2節(jié)相同。

標準曲線：配制不同質量濃度梯度酸類化合物標準液，取每個梯度標準液18 mL進行LLME-GC-MS分析。標準曲線繪制方法與1.3.2節(jié)相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0對定量數(shù)據(jù)進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用SIMCA-P+（v13.0）進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物含量差異分析

采用LLME-GC-MS和HS-SPME-GC-MS方法在單糧和多糧釀造的馥合香型白酒酒醅中共鑒定出86 種揮發(fā)性化合物，其中酯類34 種，酸類9 種，醇類8 種，醛酮類4 種，呋喃類4 種，內酯類2 種，芳香族12 種，酚類7 種，含氮化合物4 種，以及含硫化合物2 種。

不同原料釀造的酒醅在發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的生成量相差不大。與發(fā)酵前酒醅中含有的揮發(fā)性化合物總量相比，單糧酒醅中揮發(fā)性化合物總量增加3.09 g/kg，多糧酒醅中揮發(fā)性化合物總量增加3.03 g/kg，單糧酒醅中的揮發(fā)性化合物總生成量比多糧酒醅高1.94%（表1）。

表1 不同原料釀造白酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物增量的比較Table 1 Comparison of volatile compounds increments during liquor fermentation from single and multiple grains

相比多糧酒醅，單糧酒醅在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的酚類和酸類化合物。酚類化合物具有一定的抗菌和抗氧化活性[15]，但多是白酒中的異嗅物質[16]，主要來源于原料中木質素的降解[17]。酚類化合物在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過程中含量分別增加3.71 mg/kg和2.4 mg/kg，單糧酒醅中酚類化合物含量比多糧酒醅多產(chǎn)生了35.31%。通常，單一高粱原料中酚類化合物的含量顯著高于其他釀酒原料，且在發(fā)酵和蒸餾過程中，微生物可以將原料中的谷物酚類物質分解成揮發(fā)性的酚類物質，部分谷物酚類物質也會殘留在酒醅當中[18]，進一步解釋了單糧酒醅在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生更多酚類物質的原因。酸類化合物不僅是白酒中重要的呈香、呈味物質，同時也影響著微生物的生長代謝[19-21]。原料和酒曲中糖在微生物的作用下分解產(chǎn)生大量有機酸類物質[19]。酸類在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過程中含量分別增加了1.39 g/kg和1.0 g/kg，單糧酒醅比多糧酒醅多產(chǎn)生了28.06%酸，與文獻報道的結果類似[22]。

多糧酒醅在發(fā)酵過程中較單糧酒醅產(chǎn)生更多的醇類和含氮化合物。醇類化合物主要來源于糖和氨基酸的降解[23]，是兩種酒醅在發(fā)酵過程中生成量差異最大的一類化合物。在發(fā)酵過程中，單糧和多糧酒醅中醇類化合物含量分別增加2.89 mg/kg和12.83 mg/kg，多糧酒醅中醇類含量比單糧酒醅多產(chǎn)生了3.44 倍。其中含量差異較大的化合物為2-甲基丙醇和3-甲基丁醇，均在多糧酒醅發(fā)酵過程中生成量較高。含氮化合物也是兩種酒醅發(fā)酵過程中生成量差異較大的一類化合物，本研究共檢測到4 種含氮化合物，包括3 種吡嗪類物質和2-乙?；量诙嗉Z酒醅中含量較高。含氮化合物在單糧酒醅中含量增加0.35 mg/kg，在多糧酒醅中含量增加0.96 mg/kg，多糧酒醅中含氮化合物的含量比單糧酒醅多產(chǎn)生了174%；研究發(fā)現(xiàn)多糧酒醅中雜環(huán)化合物的種類和含量較高，與本實驗的研究結果類似[6,17]。

雖然單糧和多糧釀造的白酒酒醅中檢測到化合物種類基本相同，產(chǎn)生的化合物總量相差不大，但是各類化合物在發(fā)酵過程中的生成量存在一定差異。這可能是由于不同的原料品種具有不同的化學成分組成以及有差異的微生物群落結構[6-7]，導致發(fā)酵過程中微生物代謝生長環(huán)境存在一定的差別，進而影響到酒醅中揮發(fā)性成分的生成。

2.2 單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過程中的關鍵差異化合物

為了找出單糧和多糧釀造的白酒在發(fā)酵過程中可能存在的關鍵差異化合物，應用OPLS-DA模型分別對兩種酒醅中檢測到的86 種揮發(fā)性化合物在發(fā)酵過程中的增量進行分析（圖1）。該模型能將兩種酒醅明顯區(qū)分開，模型解釋率和模型預測能力Q2分別為0.508、0.973、0.505，其中接近于1且Q2＞0.5，說明模型質量較好。根據(jù)OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（VIP＞1.0）篩選出潛在的差異化合物，然后對其進行ANOVA，將其中具有顯著性差異的化合物（P＜0.05）認為是單糧和多糧釀造白酒酒醅中的關鍵差異化合物。

圖1 不同原料釀造白酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物增量的OPLS-DA得分圖Fig. 1 OPLS-DA score plot for volatile compound increments during liquor fermentation from single and multiple grains

通過OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，單糧和多糧釀造白酒酒醅在發(fā)酵過程中的關鍵差異化合物有6 種，其中包括兩種酯類物質，分別為乙酸己酯和肉豆蔻酸乙酯；兩種芳香族類物質，分別為苯乙醛和苯甲醇；以及兩種含氮化合物，分別為6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。各化合物在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過程中的增量變化如表2所示，除苯乙醛以外，其他的關鍵差異化合物均在多糧酒醅發(fā)酵過程中的生成量較高。

表2 發(fā)酵過程中關鍵差異化合物增量的比較Table 2 Comparison of the contents of key differential compounds during the fermentation process

研究發(fā)現(xiàn)，單糧釀造有利于酒醅中苯乙醛含量的累積。苯乙醛是白酒中重要的香氣化合物，具有玫瑰花香，主要由原料中的苯丙氨酸脫氨基和羰基產(chǎn)生，可在還原酶作用下被還原為苯乙醇[23]。單糧和多糧酒醅中苯乙醛含量分別增加183.09 μg/kg和54.04 μg/kg。單糧酒醅中苯乙醛含量比多糧酒醅多產(chǎn)生了70.48%。這主要是由于高粱中所含的蛋白質含量高于多種糧食混合的蛋白質含量[24]，且高粱具有較高含量的苯丙氨酸，苯丙氨酸可以在氨基酸轉氨酶作用下生成更多的苯乙醛等物質[25]，使得單糧酒醅中苯乙醛生成量更高。該研究結果與前期關于濃香型白酒釀造體系中苯乙醛含量差異研究結論具有一致性[26]。

多糧釀造有利于酒醅中乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。其中，6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均屬于吡嗪類物質，在多糧酒醅中的生成量分別比單糧酒醅高164%和539%。本研究還檢測到了2,3,5,6-四甲基吡嗪，其在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過程中含量分別增加11.75 μg/kg和16.05 μg/kg，多糧酒醅比單糧酒醅多產(chǎn)生了36.58%。多糧酒醅在發(fā)酵過程中吡嗪類物質總含量增加了591.9 μg/kg，顯著高于單糧酒醅（P＜0.05）。吡嗪類物質是白酒中特有的風味成分，具有烘烤和堅果香氣[21,23]。Fan Wenlai等[17,27]對洋河大曲、五糧液、劍南春等濃香型白酒中的香氣成分進行分析，發(fā)現(xiàn)相比于洋河大曲（單糧型白酒），五糧液和劍南春等多糧型白酒中可能含有更多的吡嗪；Tan等[6]研究發(fā)現(xiàn)單糧酒醅中吡嗪類化合物的種類和含量均低于多糧混合酒醅，這與本實驗的結果類似。這些結果表明，多糧酒醅在發(fā)酵過程中生成更高含量的吡嗪類化合物，這可能是多糧酒醅不同于單糧酒醅的典型特征。

白酒中的吡嗪類化合物主要來源于微生物的代謝反應，通常產(chǎn)生于堆積發(fā)酵、入池發(fā)酵和蒸餾過程[28]。其生物合成途徑可分為2 個階段：第1階段是通過枯草芽孢桿菌糖代謝和氨基酸轉化過程積累代謝產(chǎn)物乙偶姻和氨，第2階段是代謝產(chǎn)物乙偶姻與發(fā)酵環(huán)境中的氨發(fā)生非酶促反應生成吡嗪類化合物[28-29]。相比于單一高粱發(fā)酵，多種糧食的混合提高了白酒酒醅發(fā)酵過程中淀粉和還原糖的含量（圖2），使酒醅中葡萄糖含量增加，可能促進了吡嗪類物質的前體乙偶姻的生成從而提高了吡嗪類物質的含量[30]，因此在釀造過程中使用多糧為原料更有利于酒醅中吡嗪類化合物的生成。另外，吡嗪類物質是醬香型和芝麻香型白酒的重要香氣成分[31]，對于兼具濃香-醬香-芝麻香的馥合香型等香型白酒而言，酒醅中吡嗪類物質含量較高可能對白酒整體風味具有一定的貢獻。

圖2 不同原料品種酒醅中淀粉（a）和還原糖（b）含量變化Fig. 2 Changes in starch (a) and reducing sugar (b) contents of two fermented grains during fermentation

3 結 論

本實驗采用HS-SPME-GC-MS和LLME-GC-MS的方法，在單糧和多糧馥合香型白酒發(fā)酵過程中的酒醅中共檢測到86 種化合物。雖然單糧和多糧釀造的白酒酒醅中檢測到化合物種類相同，產(chǎn)生的化合物總量相差不大，但是各類化合物在發(fā)酵過程中的生成量存在一定差異。單糧發(fā)酵有利于酚類和酸類化合物生成，而多糧發(fā)酵有利于醇類和含氮化合物的生成。采用OPLS-DA篩選出單糧和多糧釀造白酒酒醅中的關鍵差異化合物，發(fā)現(xiàn)單糧有利于苯乙醛的生成；而多糧有利于乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。綜合分析發(fā)現(xiàn)，多糧酒醅在發(fā)酵過程中生成更高含量的吡嗪類化合物，這可能是多糧酒醅不同于單糧酒醅的典型特征。本研究分析了單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性組分形成的差異，確定不同原料對白酒發(fā)酵過程的影響，對進一步優(yōu)化白酒發(fā)酵生產(chǎn)工藝、揭示白酒發(fā)酵機理具有一定指導意義。