周天慈，何宏魁，周慶伍，曹潤潔，馬葉勝，杜海*，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽 亳州，236800)

根據(jù)白酒行業(yè)的報告，2019年中國白酒排行前50中，濃香型白酒占比54%，占據(jù)了中國白酒的大半江山[1]，而濃香型白酒的釀造離不開中高溫大曲的參與[2]。大曲俗稱“酒之骨”，為中國白酒發(fā)酵提供多種微生物。其中，以霉菌和酵母菌為主的真菌，是白酒發(fā)酵的重要功能微生物，可以分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶[3]。傳統(tǒng)中高溫大曲的生產(chǎn)是自然接種的自發(fā)固態(tài)發(fā)酵過程[4]。在發(fā)酵過程中，未經(jīng)高壓滅菌的原料在從原料到成熟大曲的階段會暴露于許多環(huán)境(例如空氣、地面等)中[5]。因此，原材料和加工環(huán)境都是大曲菌群的重要來源。

隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，研究者可以借助高通量測序技術(shù)，進一步深入分析中高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)[6]。楊旭等[7]利用高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)中高溫大曲在發(fā)酵開始及結(jié)束時，細菌的結(jié)構(gòu)組成變化不大，乳桿菌屬(Lactobacillus)是整個大曲制作過程的優(yōu)勢菌屬，而當曲溫達到頂溫時，克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)成為明顯優(yōu)勢菌群。在發(fā)酵前期真菌以根霉屬(Rhizopus)、假絲酵母屬(Candida)及曲霉屬(Aspergillus)為主，發(fā)酵后期以毛霉屬(Mucor)和曲霉屬為主。李靜心等[8]使用高通量測序技術(shù)解析中高溫大曲與高溫大曲真菌群落的結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)中高溫大曲的真菌以酵母菌為主，霉菌僅占25%左右。其中，東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)等真菌為中高溫大曲所特有。目前利用高通量測序技術(shù)解析中高溫大曲菌群結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)大量涌現(xiàn)，極大的擴展我們對于中高溫大曲的認識。然而，關(guān)于中高溫大曲微生物菌群溯源仍缺乏系統(tǒng)性的研究。

針對以上問題，我們以中高溫大曲為對象，采用高通量擴增子測序技術(shù)解析了大曲制作過程、原料及多種環(huán)境中的微生物菌群結(jié)構(gòu)組成，并采用微生物溯源分析手段分析了大曲微生物的來源。這項研究對于認識中高溫大曲的微生物來源提供了新見解，為制曲工藝的優(yōu)化提供了科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品收集于安徽省某酒廠，選擇3個曲房作為平行跟蹤采集樣本。在大曲制作之前，采集環(huán)境樣本，分別從室外地面(HSD)、室內(nèi)空氣(HKQ)、室內(nèi)草席(HCX)、室內(nèi)墻壁(HQB)、室內(nèi)曲架(HQJ)、室內(nèi)屋頂(HWD)，6個位置采集環(huán)境樣品(圖1)，具體環(huán)境樣品的采集方法參考DU等[9]的取樣方法。大曲樣本分別在大曲發(fā)酵開始與發(fā)酵結(jié)束時采集，每個曲房約500 g。原料樣本從倉庫中隨機收集原料樣品(500 g)。最后，將所有27個樣品，包括6組環(huán)境樣品、原料樣品(YXM)、發(fā)酵開始大曲(YQ)、發(fā)酵結(jié)束大曲(MQ)，一式三份轉(zhuǎn)移到冰上的實驗室中，并在-80 ℃下保存直至提取DNA。

圖1 環(huán)境樣品采集示意圖Fig.1 Schematic diagram of environmental sample collection

1.2 試劑與儀器

氯化鈉、三氯甲烷、乙醇、異戊醇，國藥集團化學試劑(北京)有限公司；飽和酚溶液，生工生物工程(上海)股份有限公司。

NanoDrop蛋白核酸測定分光光度計，Thermo FisherScientific公司；高速冷凍離心機，Eppendorf 公司；Illumina MiSeq PE300、HiSeq測序平臺，Illumina公司。

1.3 核酸提取及測序

大曲環(huán)境及原料樣品基因組總DNA提取參考SONG等[10]的方法。使用NanoDrop儀器檢測基因組總DNA的濃度，并將提取的基因組DNA貯存在-80 ℃的冰箱中，以進行后續(xù)實驗。將每個樣品的基因組DNA進行3次PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考HERTZ等[11]的方法?；旌贤粋€樣本的PCR產(chǎn)物后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后構(gòu)建MiSeq文庫，并使用Illumina MiSeq PE300測序平臺進行測序，以獲得樣品中微生物群落的擴增子基因序列。

1.4 生物信息學分析

通過QIIME軟件分析和處理樣品微生物群落的擴增子基因序列，去除質(zhì)量較差和含嵌合體的序列，并將相似度>97%的序列聚類為1個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。通過NCBI BLAST軟件將代表性的OTU基因序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，以獲得OTU物種信息。然后，通過NCBI的BLAST軟件將高質(zhì)量的基因序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，以獲得該基因序列的物種信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析及繪圖

統(tǒng)計分析采用 SPSS v.22進行，顯著性水平設(shè)定在0.05；Source Tracker(0.9.8)用于預(yù)測大曲中微生物群落的來源[12]；采用Origin 9.0繪圖，Adobe Illustrator CC 2019進行圖片整合。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲、原料及制作環(huán)境的微生物多樣性分析

本研究通過豐富度指數(shù)(Chao1)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(phylogenetic diversity (PD) whole tree)評價大曲、原料與環(huán)境的微生物多樣性。如圖2所示，在環(huán)境樣品中，室外地面中微生物的多樣性最高，室內(nèi)屋頂中微生物的多樣性最低。我們發(fā)現(xiàn)從曲房室外到曲房室內(nèi)環(huán)境樣品中微生物的多樣性都是逐漸降低的，因此得出從曲室外到曲室內(nèi)是微生物菌種選擇富集的過程。

圖2-a、圖2-b表明發(fā)酵結(jié)束時大曲中的細菌多樣性比發(fā)酵開始時顯著提高(P<0.05)，也高于環(huán)境樣品及原料。從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束，大曲細菌群落的多樣性增加。而圖2-c、圖2-d表明，發(fā)酵結(jié)束時大曲中的真菌多樣性低于發(fā)酵開始時的真菌多樣性。其中，細菌多樣性的變化與DU等[9]關(guān)于中溫大曲的研究結(jié)果一致，而真菌多樣性的變化則與之相反，這可能是不同品溫大曲制作過程中環(huán)境差異導(dǎo)致[13]。

2.2 細菌屬水平分析

高通量測序顯示所有樣品(大曲、原料及環(huán)境樣品)中在細菌屬水平共檢測到461個屬，大曲(發(fā)酵開始及發(fā)酵結(jié)束的大曲)中檢測到338個屬。其中，發(fā)酵結(jié)束時大曲中可檢測到334個屬，發(fā)酵開始大曲中僅有111個屬，而123個屬僅在制曲原料或環(huán)境樣品中能檢測到。

為了進一步分析大曲中細菌微生物群落，本研究將大曲、環(huán)境及原料中相對豐度>4%的屬定義為優(yōu)勢屬，得到其屬水平信息如圖3-a所示，大曲、制曲原料及環(huán)境中的細菌主要歸屬于19個屬，且不同樣品中占據(jù)主要豐度的細菌幾乎均不相同。其中，環(huán)境樣品中室外地面檢測到的細菌以考克氏菌屬[Kocuria，(17.44±0.05)%]為主；在室內(nèi)空氣和室內(nèi)曲架檢測到的細菌以鏈霉屬(Streptomyces)為主，分別占(40.66±0.37)%、(79.40±0.01)%；室內(nèi)草席檢測到的細菌中葡萄球菌屬[Staphylococcus，(58.32±0.01)%]的豐度最高；室內(nèi)墻壁檢測到的細菌以放線孢菌屬[Actinomycetospora，(41.51±0.14)%]為主；室內(nèi)屋頂檢測到的細菌糖多孢菌屬[Saccharopolyspora，(66.36±0.19)%]的豐度最高。而原料中檢測到的細菌擬諾卡氏菌屬[Nocardiopsis，(53.15±0.17)%]的豐度最高。早期研究表明，葡萄球菌屬、擬諾卡氏菌屬等在多種大曲中都有報道，是大曲中重要的功能細菌屬[14]。同時，中高溫大曲的生產(chǎn)原料主要以小麥為主，大部分不添加陳曲[15]，因此制曲環(huán)境在中高溫大曲的制作過程中起著至關(guān)重要的作用。

a、b-細菌的alpha多樣性；c、d-真菌的alpha多樣性圖2 大曲、原料及制作環(huán)境微生物的多樣性Fig.2 The diversity of microorganisms in Daqu, raw materials and environmental samples注：圖中不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

在發(fā)酵開始時大曲檢測到的細菌以魏斯氏菌屬[Weissella，(44.57±0.09)%]為主，發(fā)酵結(jié)束時大曲中細菌則以乳桿菌屬[(24.47±0.13)%]為主。這種變化可能是大曲制作過程中曲中含水量、酸度、溫度等理化性質(zhì)變化對微生物的篩選作用導(dǎo)致的[16]。此外，發(fā)酵結(jié)束時大曲中魏斯氏菌屬[(3.32±0.12)%]、芽孢桿菌屬[(1.102±0.01)%]、葡萄球菌屬(Staphylococcus，(0.3272±0.02)%)等也占據(jù)較高的豐度，而已有研究表明乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬等是大曲中重要的功能細菌[17]。其中葡萄球菌屬可代謝產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇及乙偶姻等多種風味物質(zhì)，為白酒中風味物質(zhì)提供合成前體[18]。乳桿菌屬、魏斯氏菌屬等可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等多種有機酸，這些物質(zhì)在白酒中是重要的風味成分[14]。而芽孢桿菌屬能代謝淀粉酶、蛋白酶等多種水解酶，在維持大曲生態(tài)平衡中起著重要作用[19]。同時我們發(fā)現(xiàn)，海命菌屬(Marivita)、原綠球藻(Prochlorococcus)僅在發(fā)酵開始和發(fā)酵結(jié)束的大曲中檢測到，其他環(huán)境樣品及原料均未發(fā)現(xiàn)，可能來源于大曲用水。

為更直觀地說明大曲與原料及制曲環(huán)境中細菌的關(guān)系，本研究分別通過基于weighted UniFrac距離的主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)和基于Bray-Curtis距離的層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)進一步表征它們的關(guān)系(圖3-b,圖3-c)。PCoA結(jié)果顯示前2個坐標軸可代表細菌群落的44.29%，而且PCoA與HCA分析結(jié)果與群落結(jié)構(gòu)結(jié)果一致，室內(nèi)草席、室內(nèi)空氣、室外地面、室內(nèi)墻壁細菌群落距離較近，室內(nèi)曲架、室內(nèi)屋頂?shù)募毦郝渚嚯x較近，發(fā)酵開始大曲與原料的細菌群落距離較近，而發(fā)酵結(jié)束大曲與其他任何樣品都距離較遠。因此，我們推測原料是發(fā)酵開始大曲中細菌群落的主要來源，經(jīng)過大曲的制作過程，發(fā)酵開始時大曲中的細菌逐漸演替為發(fā)酵結(jié)束時大曲中的細菌。

a-屬水平大曲優(yōu)勢細菌分布(平均豐度>4%)；b-基于weighted UniFrac距離的細菌主坐標分析；c-細菌層次聚類分析圖3 大曲、原料及環(huán)境樣品細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community compositions of Daqu, raw materials and environmental samples注：圖a中圓大小根據(jù)平均豐度的開方值設(shè)置(圖4同)

2.3 真菌屬水平分析

高通量測序顯示所有樣品中在真菌屬水平共檢測到69個屬，大曲中可檢測到31個屬。其中發(fā)酵結(jié)束大曲中可檢測到31個屬，發(fā)酵開始大曲中僅有25個屬，多的6個屬則可能來自制曲環(huán)境或者原料。已有研究共檢測到中溫大曲真菌79個屬[9]，這可能是中高溫大曲與中溫大曲制作環(huán)境與程序差異導(dǎo)致的。

由于真菌屬水平數(shù)量較少，為和上文細菌優(yōu)勢屬數(shù)目一致，本研究將大曲、環(huán)境及原料中相對豐度>2%的屬定義為優(yōu)勢種屬，得到其水平信息如圖4-a所示，曲霉屬和根霉屬，在所有樣品中均占據(jù)極高的豐度。而早期研究證明，根霉屬和曲霉屬可以代謝產(chǎn)生大量的高活性蛋白酶和葡糖淀粉酶，為大曲中酶的主要來源[20]。在發(fā)酵開始時大曲中曲霉屬[(39.14±0.21)%]、假絲酵母屬[(6.39±0.31)%]、根霉屬[(0.3739±0.01)%]為優(yōu)勢真菌屬。這與楊旭等[7]解析的河南地區(qū)中高溫大曲發(fā)酵前期結(jié)果相似，都以假絲酵母屬、根霉屬和曲霉屬為主。在發(fā)酵結(jié)束時，大曲中除了根霉屬[(30.65±0.53)%]、假絲酵母屬[(23.68±0.11)%]、曲霉屬[(12.9±0.32)%]之外，嗜熱子囊菌屬[Thermoascus，(23.96±0.01)%]也逐漸成為優(yōu)勢真菌屬。其中，假絲酵母屬真菌可以代謝產(chǎn)生乙酸乙酯、4-羥基-2丁酮等多種風味物質(zhì)，是白酒發(fā)酵中的重要功能微生物[21]。以前的研究表明，在河南地區(qū)的中高溫大曲處于發(fā)酵后期時，真菌以毛霉屬和曲霉屬為主[7]，這可能是兩地區(qū)制曲用水及原料不同導(dǎo)致的。同時與其他樣品中某一種真菌占據(jù)高的豐度相比，在發(fā)酵結(jié)束時大曲檢測到的真菌結(jié)構(gòu)較為均勻，這說明在大曲制作過程中真菌微生物發(fā)生了生物篩選。

使用PCoA與HCA分析結(jié)果進一步表明大曲、原料及環(huán)境中檢測到的真菌群落分布規(guī)律(圖4-b、圖4-c)。室內(nèi)草席、室內(nèi)空氣、室外地面、室內(nèi)曲架的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似；而與室內(nèi)墻壁、室內(nèi)的真菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。

a-屬水平大曲優(yōu)勢真菌分布(平均豐度>2%)；b-基于weighted UniFrac距離的真菌主坐標分析；c-真菌層次聚類分析圖4 大曲、制曲原料及環(huán)境真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal community compositions of Daqu, raw materials and environmental samples

2.4 大曲中的優(yōu)勢微生物來源分析

利用SourceTracker，以大曲生產(chǎn)的原料及制曲環(huán)境的優(yōu)勢屬微生物為來源端，以發(fā)酵開始時大曲的優(yōu)勢屬微生物為接受端，追蹤發(fā)酵開始大曲中微生物的來源，并依此判斷發(fā)酵開始時大曲中微生物的來源(圖5)。

a-發(fā)酵開始大曲微生物不同來源分析；b-發(fā)酵開始大曲細菌的溯源分析；c-發(fā)酵開始大曲真菌的溯源分析圖5 發(fā)酵開始大曲優(yōu)勢微生物溯源分析Fig.5 Source tracking analysis of dominant microorganisms in new Daqu

圖5-a顯示，發(fā)酵開始時大曲中細菌89.3%來自于原料小麥。其中原料是發(fā)酵開始時大曲中糖多孢菌屬、葡萄球菌屬、擬諾卡氏菌屬、短桿菌屬等的主要來源(圖5-b)。早期研究表明，這些細菌在小麥內(nèi)生菌中也是主要的種群[22]。同時，室內(nèi)草席還對發(fā)酵開始時大曲中細菌貢獻了5.6%。其中，室內(nèi)草席是魏斯氏菌屬、串珠菌(Leuconostoc)等的主要來源。以上分析結(jié)果表明，制曲原料是發(fā)酵開始大曲中細菌主要來源，而制曲的環(huán)境對細菌貢獻較少。

發(fā)酵開始大曲中的真菌主要來自于室外地面，貢獻了53.7%的微生物(圖5-c)。其中，發(fā)酵開始大曲中鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢菌(Cladosporium)、根霉屬等真菌主要來源于室外地面。此外，發(fā)酵開始大曲中的真菌23%來源于室內(nèi)屋頂。其中，發(fā)酵開始大曲中曲霉屬、Trichomonascus等主要來源于室內(nèi)屋頂。以上分析結(jié)果表明，制曲的環(huán)境是發(fā)酵開始大曲中真菌主要來源，而原料對真菌的貢獻不大。

3 結(jié)論

本研究主要解析了環(huán)境及原料對中高溫大曲的影響。研究結(jié)果表明，從曲房外到曲房內(nèi)環(huán)境樣品中微生物的多樣性都是逐漸降低的，這是微生物菌種選擇、富集的過程。從大曲發(fā)酵開始到結(jié)束，細菌群落多樣性增加，而真菌群落多樣性降低。發(fā)酵開始時大曲中檢測到111個細菌屬，主要以魏斯氏菌屬為主；結(jié)束時大曲中可檢測到334個細菌屬，主要以乳桿菌屬為主。發(fā)酵開始時大曲中檢測到25個真菌屬，結(jié)束時曲中檢測到31個真菌屬，而發(fā)酵開始和結(jié)束大曲中的真菌主要以曲霉屬和根霉屬為主?；赟ource Tracker計算的結(jié)果，發(fā)酵開始大曲中89.3%的細菌來自于原料，5.6%來自于室內(nèi)草席；發(fā)酵開始時大曲中真菌53.7%來源于室外地面，室內(nèi)屋頂貢獻了23.0%。綜上所述，本研究強調(diào)中高溫大曲的制造環(huán)境(主要是室外地面和室內(nèi)屋頂)是大曲真菌群落的主要來源，而原材料則是細菌群落的主要來源，從生物學的角度為制曲工藝的調(diào)整、優(yōu)化甚至現(xiàn)代化提供參考依據(jù)。