李瀟 陳娟 何菊 周繼國 羅元宇 程方俊

1.貴州省盤州市動(dòng)物防疫監(jiān)測服務(wù)站 553537

2.貴州省六盤水市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 553600

3.貴州省六盤水市水城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 553600

4.貴州省威寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 553100

5.西南大學(xué) 402460

奶牛乳房炎是由物理，化學(xué)或微生物等因素刺激侵入奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)，其發(fā)病率比較高，表現(xiàn)為奶牛產(chǎn)奶量下降，發(fā)情期延長，繁殖性能降低。而葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要的細(xì)菌之一，該菌在食物中被人攝入后，可引起食物中毒。

本研究是對(duì)榮昌區(qū)不同奶牛場的78 份奶牛中檢測有乳房炎的27 份牛奶乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離，并檢測細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，篩選出針對(duì)葡萄球菌的敏感藥物，從而為奶牛乳房炎的防治，臨床指導(dǎo)及葡萄球菌的耐藥性研究，提供理論依據(jù)。

1 材料

普通瓊脂培養(yǎng)基；兔血；高鹽瓊脂培養(yǎng)基；LB 營養(yǎng)肉湯；革蘭氏染色液；各類抗生素藥物藥敏紙片；細(xì)菌生化管；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒（寶生物工程有限公司）；DNA 膠回收試劑盒；DNA Marke；16S rRNA 基因引物（由武漢金開瑞有限公司合成）。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、電泳儀、梯度PCR儀、冷凍離心機(jī)、雙人單面凈化工作臺(tái)、接種環(huán)、顯微鏡和移液槍等。

2 方法

隨機(jī)采取榮昌區(qū)幾個(gè)奶牛場的泌乳奶牛乳樣78 份。采集乳樣之前先用溫水來清洗乳房，并消毒乳頭及和周圍部分。收集樣品時(shí)，棄掉前三把奶、后取10mL 左右的乳樣擠入滅菌好的試管中，標(biāo)記好試管，并詳細(xì)記錄。

進(jìn)行CMT 試驗(yàn)來判斷患有隱性乳房炎的情況，按照農(nóng)業(yè)部所制定的《奶牛乳房炎防治技術(shù)指南（試行）》進(jìn)行診斷。

吸取每個(gè)乳樣的100ul,傾注于兔鮮血平板和LB 固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)24h 后，觀察菌落形態(tài)，挑起可疑單個(gè)菌落少許進(jìn)行下一步純化后革蘭氏染色，鏡檢,當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)紫色葡萄串珠狀的細(xì)菌初步懷疑為葡萄球菌。

將分離菌株分別進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)、溶血作用、產(chǎn)生色素、發(fā)酵木糖、發(fā)酵甘露醇、堿性磷酸酶、發(fā)酵麥芽糖相關(guān)試驗(yàn)等，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h～48h，觀察并記錄結(jié)果。具體步驟參照東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

提取葡萄球菌基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以基因組DNA 為模板，反應(yīng)引物為細(xì)菌16SrRNA 基因通用引物。PCR 擴(kuò)增采用25μl 體系：PCR 酶12.5μl,滅菌雙蒸水8.5μl，提取的基因組2.0μl,上游引物1μl，下游引物1μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s 經(jīng)35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察目的條帶，結(jié)果照相保存；PCR 產(chǎn)物按照PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物由公生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

將培養(yǎng)好的葡萄球菌肉湯與0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度進(jìn)行比濁后，用滅菌好的涂菌棒將20uL 葡萄球菌菌液均勻涂于整個(gè)平板表面。邊涂邊轉(zhuǎn)動(dòng)平皿重復(fù)3 次，使得接種細(xì)菌充分的分布在營養(yǎng)瓊脂平板表面，放置1～2min,倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后用游標(biāo)卡尺測量其紙片的抑菌直徑。

3 結(jié)果

3.1 CMT 試驗(yàn)結(jié)果78 份乳樣檢測出有27 份患有隱性乳房炎，部分結(jié)果如圖1。

圖1 CMT 試驗(yàn)判定

3.2 形態(tài)學(xué)觀察葡萄球菌在鮮血營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24h 后出現(xiàn)圓形或者橢圓形凸起、光滑、濕潤、表皮葡萄球菌菌落乳白或灰白，實(shí)心圓葡萄串狀，該菌以單，雙葡萄狀排列，不透明，直徑約1.5～2mm（圖2）；在高鹽瓊脂上菌落特征生長初期基本同血液瓊脂平板,金黃色葡萄球菌出現(xiàn)黃玉米色（圖3）；鏡檢結(jié)果顯示，該菌為革蘭氏陽性菌（圖4）

圖2

圖3

圖4

3.3 生化鑒定結(jié)果經(jīng)生化鑒定R3 為金黃色葡萄球菌，R5為表皮葡萄球菌，R1 為溶血葡萄球，RC4 為腐生葡萄球菌。

3.4 電泳結(jié)果經(jīng)16S rRNA 基因擴(kuò)增，獲得凝膠電泳片段與目的片段大小相符（圖5）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送至生物公司測序。

圖5 PCR 擴(kuò)增的16S rRNA 電泳結(jié)果

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)2008 年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)按敏感、中介、耐藥三級(jí)報(bào)告判定。結(jié)果顯示該16 株分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、麥迪霉素和氧氟沙星等抗生素敏感性較高。

4 分析與討論

該研究結(jié)果表明：一、用CMT 試驗(yàn)檢測出榮昌區(qū)患有隱性乳房炎奶牛的發(fā)病率為34.6%，發(fā)病率低于其他地區(qū)，這可能與榮昌奶牛養(yǎng)殖場近年來飼養(yǎng)管理水平提高有一定關(guān)系。二、檢測的27 份患有乳房炎奶樣中共鑒定出葡萄球菌有16 株，其金黃色葡萄球菌的檢出率較低，可能是不同地區(qū)對(duì)奶牛乳房炎葡萄球菌的檢出率不同。三、藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：檢出的葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、麥迪霉素和氧氟沙星高度敏感，敏感率均在88%以上，對(duì)青霉素和多粘菌素B 耐藥。通過這次的研究結(jié)果可以為該地區(qū)奶牛乳房炎進(jìn)行治療并提供參考依據(jù)。