張正英 崔乃元 王云平 張漢青 趙維章 馬立才*

1.青海省動物疫病預(yù)防控制中心 810001

2.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 100095

牦牛是青海省優(yōu)勢畜種之一，是十分寶貴的畜種資源，被譽為“高原之舟”。青海省現(xiàn)存欄牦牛481 萬頭，占全國牦?？倲?shù)的34.6%，能繁母牛240 萬頭，年出欄牦牛14.6 萬頭，年產(chǎn)牦牛肉13.2 萬噸，牦牛市場前景不可估量。在牦牛飼養(yǎng)生產(chǎn)過程中，四環(huán)素類藥物作為一種廣譜抗生素，是疾病治療的常用藥，主要將其用于細菌感染性疾病的預(yù)防和早期治療，容易導(dǎo)致四環(huán)素以殘留進入人體或生態(tài)系統(tǒng)，給動物源性食品帶來嚴重的安全問題。

目前檢測動物組織中四環(huán)素的方法較多，國內(nèi)外的殘留檢測方法主要有LC-Q-TOF 和LC-MS/MS 等方法。色譜法和質(zhì)譜-色譜聯(lián)用法等儀器法的靈敏度和準確度較高，有些方法的靈敏度能達到0.1ng/g，一般為確證方法，但儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜和需要專業(yè)技術(shù)人員操作，分析成本高，不適用于基層實驗室的大規(guī)模樣本檢測。

但是目前為止，還沒有應(yīng)用時間分辨免疫層析技術(shù)檢測青海牦牛中四環(huán)素藥物殘留的報道。本研究以青海牦牛肉作為研究對象，采用熒光定量免疫層析檢測方法，對牦牛肉中四環(huán)素類藥物殘留進行檢測，并用高效液相色譜法對時間分辯熒光定量免疫層析檢測結(jié)果進行評價對比分析，以便找到牦牛肉中四環(huán)素殘留量的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品牦牛肉樣品由青海主月畜牧業(yè)有限公司、青海夏華肉食品有限公司、青海裕泰肉食品等公司提供。

1.2 實驗儀器立式高速冷凍離心機（湖南湘儀HR/T20MM），電子天平（梅特勒XS204DR），微量移液器（德國Eppendorf），德國超純水機（德國密尼博純水機），固相萃取小柱（WatersHLB型，60mg，3mL），pH 計（上海雷磁ZD-2A 型），檢測卡恒溫孵育器、時間分辨熒光免疫定量分析儀（北京維德維康），高效液相色譜儀（美國Agilent1100，配PAD 二級陣列管檢測器）。

1.3 化學(xué)試劑甲醇、乙腈、磷酸氫二鉀、鹽酸、氫氧化鈉、吐溫20、乙酸乙酯、正己烷；四環(huán)素標準品（純度≥96%）美國Sigma 公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 時間分辨熒光免疫定量分析法

1.4.1.1 樣品前處理 樣品前處理：稱取1.00±0.02g 勻質(zhì)后的樣品于10ml 離心管中，加入2ml 樣品提取液、350ul 體系調(diào)整液，劇烈渦動1min，4000g 離心5min，上清備用。

1.4.1.2 樣品測定 實驗前，將檢測卡和金標微孔平衡至25℃，吸取200ul 離心上清液于金標微孔中，小心吹打至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，室溫（25±2℃）孵育3min，取120ul 金標微孔中樣品滴加到加樣區(qū)并開始計時，準確反應(yīng)10min 后，插入熒光免疫定量分析儀讀數(shù)。

1.4.1.3 標準曲線及檢出限 根據(jù)維德維康公司提供四環(huán)素類藥物標準溶液，濃度分別為：0.0μg/kg，5.0μg/kg，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg，80.0μg/kg，160μg/kg，選取儀器測試四環(huán)素陰性樣本20 份，采用時間分辨熒光免疫層析方法進行測定，分別得到20 次結(jié)果的均值和相對標準偏差（SD），其平均值加上10 倍標準差，即為檢測限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 兩種檢測方法標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)

1.4.1.4 準確度與精密度測試 在牦牛肉樣品中添加濃度為10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg 四環(huán)素藥物標準溶液，平行添加3 份，用熒光免疫定量分析儀測試，回收率及變異系數(shù)見表2。

表2 加標回收及RSD 值

1.4.2 方法學(xué)比較取30 份牦牛肉樣品，分別采用時間分辨熒光免疫層析定量分析法和GB/T 21317-2007《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測方法》液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行檢測，并對兩種方法檢測結(jié)果的一致性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線與檢出限

高效液相色譜法配置四環(huán)素標準溶液濃度梯度為0.05、0.1、0.20、0.50、1.0 mg/kg，每個濃度點進行5 次平行實驗，由儀器用平均值繪制標準曲線，得到A=12.15c+65.37，相關(guān)系數(shù)為0.991 的標準曲線，以3 倍信噪比計算四環(huán)素的檢出限為0.05mg/kg。

時間分辨熒光免疫層析法，北京維德維康生物技術(shù)有限公司提供標準曲線的線性區(qū)間（IC20～IC80）為9.65～81.25μg/kg，線性相關(guān)性R2為0.9813，通過測試結(jié)果表明，四環(huán)素檢出限為10μg/kg，定量范圍為10～80μg/kg。

2.2 準確度和精密度

由表2 可知，高效液相色譜法在牦牛肉樣品中添加20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml 3 種濃度的四環(huán)素標準對照品溶液后，通過儀器進行加標回收實驗分析，平均回收率在87～106%之間。

時間分辨熒光免疫層析法，在空白牦牛肉樣品中添加3 種濃度的四環(huán)素類藥物標準溶液，添加濃度為10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg，所有樣品各添加濃度的回收率均在80～120%之間。

2.3 免疫層析方法（定量）與高效液相法測定結(jié)果比較選取經(jīng)液相色譜法和時間分辨免疫層析法同時測定的10份牦牛肉陰性樣品，同時進行加標實驗，同時每5 個樣品添加同一個標準梯度，分成2 組添加樣品，采用兩種測試方法進行定量檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3 兩種測試方法結(jié)果比較 單位：mg/kg

本實驗應(yīng)用時間分辨免疫層析法和LC-MS/MS 方法進行確認比較來檢測青海牦牛肉中四環(huán)素藥物，由表3 可知，兩種方法對四環(huán)素藥物檢測結(jié)果一致性較高。

3 結(jié) 論

本實驗通過采用時間分辨熒光免疫層析方法來檢測青海牦牛肉中四環(huán)素殘留量，定量限為10μg/kg，添加平均回收率80.0～120.0%之間，平均RSD 值為11～15%，該方法可在30 min 內(nèi)完成樣本的前處理，10min 完成定性定量檢測，肉眼視覺直接判斷陰陽性（定性），通過儀器識別內(nèi)置二維碼直接顯示檢測四環(huán)素藥物殘留含量，通過加標回收與高效液相色譜法進行方法確認，結(jié)果表明實驗結(jié)果一致性高。

由此說明，本研究的牦牛肉中四環(huán)素藥物殘留檢測方法的準確度、精密度、靈敏度均較高，可用于牦牛肉中四環(huán)素藥物的實際檢測，加之時間分辨熒光免疫層析方法操作簡單，容易上手，檢測成本低，對實驗室基礎(chǔ)設(shè)施要求不高，很容易在基層實驗室中推廣使用，可實現(xiàn)牦牛養(yǎng)殖過程中任何環(huán)節(jié)的四環(huán)素藥物殘留檢測，比如在牦牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)、銷售環(huán)節(jié)均可實現(xiàn)四環(huán)素殘留檢測，并建立數(shù)據(jù)庫，為實現(xiàn)青海牦牛肉質(zhì)量追溯體系的建設(shè)提供數(shù)據(jù)支撐。