謝 鋒，張宏杰，朱 華*

1. 廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200；2. 廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200

茶，味甘苦、微寒、無毒，李時珍在《本草綱目》中記載茶有利小便、去痰熱、下氣消食、清頭目等功效，可用于治療眼疾、風化痰以及各種原因所引起的頭痛[1]。陳藏器在《本草拾遺》中記載“諸藥為各病之藥、茶為萬病之藥”，說明茶的功用頗多。茶葉在加工過程中化學成分的種類及含量均有不同程度的變化[2]?，F(xiàn)代研究表明，茶葉中含有茶多酚、生物堿與茶多糖等多種成分，有降血壓、血脂、抗動脈粥樣硬化、抑制病菌活性和提高人體免疫力、抗腫瘤等藥理作用[3]。茶葉的解毒作用，據(jù)考證最早見于1717年的《格致鏡源》，曰“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”[4]。在少數(shù)民族聚居地，對誤服的有毒民族藥亦有用茶解毒的記載，如《云南中草藥》在昆明山海棠（掉毛草）項目下就有：“本品有劇毒，不可多服。中毒可用茶葉煎水服解救”[5]。目前關于“茶解藥毒”的考辯僅見于奚茜[6]等通過考證，認為以茶解藥毒最早見于宋代《圣濟總錄》卷146“雜療門·中毒藥”篇，但是茶葉在解藥毒方中的“權重”并不大；總結出茶解藥毒的機理為以茶送服藥以通過利尿?qū)a或以茶葉濃煎催吐減少有毒物質(zhì)的吸收。藥物經(jīng)茶汁炮制后是否真的有減毒作用，現(xiàn)代研究尚無相關文獻報道，其炮制減毒實驗研究尚屬空白，缺乏茶汁制解毒的機制理論和實驗依據(jù)。

三十六蕩為蘿藦科娃兒藤屬植物卵葉娃兒藤（Tylophora ovata（Linl）Hook.et Stend）的根及根莖，是一味傳統(tǒng)壯藥，壯名Gosamcibloegdang[7]，也稱娃兒藤，異名老君須、藤葉細辛、毛管細辛和落地蜘蛛等，有毒，具有行氣散瘀止痛和化痰止咳等功效，在民間具有多種藥用價值，除主要用于哮喘、慢性支氣管炎和毒蛇咬傷外[8-10]，還常用于癌癥的治療[11]，因其所含的娃兒藤生物堿具有顯著的抗腫瘤活性而受到廣泛關注。對三十六蕩的炮制，在《中國民族藥炮制集成》中明確記載了用茶汁制解毒：先將茶葉煎成濃汁，再將三十六蕩生品置缸中，噴入茶汁，悶潤，曬干[12]。傳統(tǒng)認為濃茶能引吐、消脂[13]，通過查閱相關文獻，發(fā)現(xiàn)大部分都只是對茶汁進行濃縮[14-15]，僅有2篇提到了濃茶汁[16-17]，即50 g茶葉加開水泡汁200 mL及每1 g茶葉用沸水量少于50 mL為濃茶。由于用茶汁制解毒的藥物較少，缺少參考，因此對記載中所用茶的種類和濃茶汁的具體制法和濃度等均有待研究。

為考察濃茶汁的制備方法，本實驗將選用不發(fā)酵的綠茶、全發(fā)酵的紅茶和后發(fā)酵的黑茶為材料，以茶多酚為對照品，采用正交設計，優(yōu)選濃茶汁的制備工藝；同時，課題組前期的實驗發(fā)現(xiàn)三十六蕩藥材經(jīng)茶汁炮制后，其生物堿含量發(fā)生了不同程度的變化，為探討不同茶葉茶汁制三十六蕩的毒性變化，將選用不發(fā)酵的綠茶和發(fā)酵完全的紅茶分別與三十六蕩炮制，并測定三十六蕩炮制前后的LD50，比較其毒性的變化，為茶汁制三十六蕩的炮制工藝和深入研究茶汁制減毒提供實驗依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣為市售綠茶、紅茶和黑茶；三十六蕩藥材購自藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學滕建北教授鑒定為蘿藦科（Asclepiadaceae）娃兒藤屬（Tylophora）植物卵葉娃兒藤（Tylophora ovata（Lindl）Hook. ex Steud.）的全草；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-1780型紫外可見分光光度計（島津儀器有限公司）；SQP電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，4 ～ 6周齡，雌雄各半，體重16 ～ 18 g，購自湖南安生美藥物研究有限公司，合格證號SCXK（湘）2019-0004，實驗前12 h小鼠禁食不禁水。

1.4 濃茶汁的制備

1.4.1 熱水浸提法

準確稱取50 g茶葉，加入一定量熱水浸泡一定時間，反復提取三次，過濾，濾液濃縮轉移至容量瓶中備用。

1.4.2 水浴提取法

準確稱取50 g茶葉，加入一定量的水，水浴鍋中加熱提取一定時間，反復提取三次，過濾，合并濾液濃縮后轉移至容量瓶中備用。

1.5 茶多酚含量測定

采用GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中分光光度法測定[18]。

1.6 正交試驗設計

以提取時間、料液比、提取溫度條件為考察因素，選用L9（33）正交表進行試驗，優(yōu)化最佳的濃茶汁提取工藝，因素水平見表1。

表1 濃茶汁提取工藝正交因素水平表Table 1 Level of orthogonal factors for extraction technology of concentrated tea juice

1.7 茶汁制娃兒藤炮制品的制備

取凈制后的三十六蕩藥材，切成小段，分別加定量的綠茶和紅茶濃茶汁，拌勻悶潤后烘干。

1.8 供試品溶液的制備[19-20]

分別將三十六蕩原藥材和不同炮制品粉碎過篩，稱取一定量粉末于圓底燒瓶中，加入95%乙醇回流提取（物料比為1∶25）3次，每次2 h，合并濾液濃縮成浸膏。灌胃使用前加入與干膏等質(zhì)量的吐溫80將提取物溶解（比例為1∶1），加入適量的純水配置，密封備用。

1.9 急性毒性實驗[21]

1.9.1 預實驗

取小鼠60只，體重20±2 g，雌雄各半，每組4只，實驗前禁食不禁水12 h。每個樣品按照不同濃度各選擇一組小鼠進行預實驗，每只小鼠均按照40 mL/kg灌胃給藥一次，分別觀察小鼠灌胃后4 d內(nèi)情況，記錄死亡時間，最后計算出各藥物的最高致死劑量（Dm，指剛好導致動物全部死亡的劑量）、最低致死劑量（Dn，指剛好不引起動物死亡的劑量）或最大給藥量，供LD50的測定實驗參考。

1.9.2 正式實驗

取小鼠170只，體重20±2 g，雌雄各半，每組10只，實驗前禁食不禁水12 h。各樣品提取物分別設置5個劑量組，藥物的稀釋配置為每個梯度為上一個梯度的0.7倍，每只小鼠均按照40 mL/kg給藥一次，3次/d，觀察7 d內(nèi)出現(xiàn)的中毒癥狀、死亡情況及各組動物的死亡數(shù)，對死亡小鼠進行解剖，肉眼觀察并記錄主要損害的器官及病理變化情況，計算出各樣品的LD50。

2 結果與分析

2.1 曲線的測定結果

方法學研究結果表明，茶多酚含量在0.032～ 0.096 mg/mL與吸光度成良好的線性關系，Y = 8.12925X-0.0113780（r = 0.9996）。

2.2 濃茶汁提取工藝正交試驗結果

由表2可知，濃茶汁提取工藝中茶多酚提取率影響的主次順序為B＞C＞A，其影響因素較大的為加水量，最小的是提取時間，最佳濃茶汁提取工藝為A3B3C2，即提取時間40 min、加水量400 mL、提取溫度95℃。

表2 濃茶汁提取工藝正交設計結果Table 2 Orthogonal design results of extraction technology of concentrated tea juice

2.3 不同方法提取的濃茶汁的茶多酚含量

由表3可知，三種不同茶葉提取的濃茶汁，水浴提取和浸提法中茶多酚提取率均為綠茶＞黑茶＞紅茶，以水浴提取方法優(yōu)于浸提方法。

表3 濃茶汁中茶多酚含量測定結果Table 3 Determination of tea polyphenols in concentrated tea juice

2.4 小鼠急性毒性實驗結果

不同炮制品對小鼠急性毒性的影響結果見表4，不同炮制品小鼠死亡情況的影響見表5。

表5 茶汁制三十六蕩不同炮制品提取物灌胃后小鼠的死亡情況Table 5 Death of mice after gavage of extracts from different processed products of Tylophora ovata made of tea juice

由表4可知，藥材經(jīng)過濃茶汁炮制后急性毒性作用變化的順序為：紅茶炮制品＞生品＞綠茶炮制品。實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠死亡時間集中在給藥后的第2 d和第3 d，且第2 d的死亡小鼠數(shù)量最多，未死亡小鼠一般在給藥后的第3 d開始恢復正常飲食及活動；存活的小鼠7 d內(nèi)小便，被毛、膚色、鼻子、眼睛與口腔分泌物均沒有異常，體重呈自然增長；灌胃后1 ～ 3 d小鼠大便顏色較正常小鼠大便深，呈深褐色；對死亡小鼠進行解剖，肉眼未發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象。

表4 茶汁制三十六蕩不同炮制品提取物對小鼠的急性毒性試驗結果Table 4 Acute toxicity test results of extracts from different processed products of Tylophora ovata made of tea juice

3 討論

3.1 濃茶汁的提取工藝

課題組根據(jù)文獻記載的濃茶汁制備方法進行了預試，發(fā)現(xiàn)50 g茶葉加水200 mL，水量太少；茶葉提取3次，第一次沖泡會有80%的量被浸出，第二次會有15%，第三次沖泡后基本達到全量浸出[17]。因此，經(jīng)反復預試與篩選，在正交設計實驗時確定了加水量及反復提取3次。

由實驗數(shù)據(jù)可知，濃茶汁中茶多酚提取率正交的極性差異為料液比＞提取溫度＞提取時間。原因可能有以下幾個方面：一是在浸泡茶汁時，有部分的茶汁殘留在茶葉上沒有過濾出來；二是過濾時有茶葉的殘渣堵塞濾紙，需經(jīng)常更換濾紙，濾紙上也殘留部分的茶多酚，有可能導致茶多酚提取率的降低。有研究表明制茶工藝與提取溫度都會對茶多酚的含量有影響[22-23]，從本次實驗結果來看，以未發(fā)酵的綠茶水浴提取的茶多酚含量最高。

3.2 茶汁制三十六蕩急性毒性

實驗結果表明三十六蕩經(jīng)綠茶汁炮制后有明顯的減毒效果，而經(jīng)紅茶汁炮制則表現(xiàn)出增毒效果。課題組同時還測定了三十六蕩炮制前后其主要毒效成分娃兒藤生物堿的含量（另文發(fā)表），通過比較發(fā)現(xiàn)濃茶汁中的茶多酚含量越高，炮制后的娃兒藤生物堿含量就越低，相關的機理還有待進一步研究。

茶葉中主要含有生物堿、多酚類、芳香物質(zhì)和茶氨酸等化學成分以及多種維生素物質(zhì)、少數(shù)礦物質(zhì)和微量元素。茶葉能與植物堿發(fā)生化學反應生成鹽，當發(fā)生植物堿中毒時，多飲茶可以降低生物堿對機體的毒副作用[24]。藍宇敬[25]等通過對藥茶方劑的研究認為，“茶解藥毒”說明不是茶解毒后減低藥效，而是使用了茶的藥用價值，起到了增效減毒的作用。三十六蕩的毒效成分主要是生物堿，通過濃茶汁炮制，有可能會降低其游離生物堿濃度，使其更多以鹽的形式存在，因此采用濃茶汁炮制三十六蕩，可以達到減輕生物堿毒副作用，有一定的科學道理。但是三十六蕩中的總生物堿既是有毒成分，也是有效成分，因此經(jīng)過濃茶汁炮制后化學成分的變化和藥理藥效作用的變化，還有待更深層次的研究。