朱 哲，楊國(guó)紅，趙季紅

長(zhǎng)期過量的食鹽攝入，不僅會(huì)增加患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)，還可對(duì)相關(guān)靶器官造成損害。多項(xiàng)研究表明，鹽敏感性高血壓等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及其靶器官損害的病理過程與巨噬細(xì)胞表型偏移密切相關(guān)?；诋?dāng)前對(duì)巨噬細(xì)胞的研究，通常將其分為M1型和M2型兩種亞型。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高鹽喂養(yǎng)下小鼠巨噬細(xì)胞表型向M1型偏移可加重機(jī)體炎性反應(yīng)，升高血壓并促進(jìn)小鼠左心室重塑。在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中本課題組發(fā)現(xiàn)高鹽刺激下小鼠巨噬細(xì)胞向M1型發(fā)生偏移的同時(shí)伴隨張力應(yīng)答增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(tonicity-responsiveelement binding protein，TonEBP)與核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)增強(qiáng)，且二者表達(dá)水平呈正相關(guān)。TonEBP可在高滲條件下被激活，參與維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)滲透壓力的平衡。位于TonEBP下游的NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與機(jī)體各類炎性反應(yīng)。對(duì)于高鹽刺激下巨噬細(xì)胞表型偏移是否和TonEBP/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)，通過調(diào)節(jié)此通路是否可以干預(yù)巨噬細(xì)胞表型偏移方向的研究還未有報(bào)道。本研究通過探討高鹽刺激下巨噬細(xì)胞表型偏移的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞相關(guān)心血管疾病的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 Raw264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)由武警特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。TonEBP基因沉默慢病毒載體設(shè)計(jì)構(gòu)建與包裝服務(wù)由上海合生基因生物公司提供；氯化鈉購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技公司；胎牛血清(FBS)、高糖培養(yǎng)液(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;引物設(shè)計(jì)合成由北京六合華大基因科技有限公司提供；RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液(RIPA buffer high)、嘌呤霉素(Puromycin)、Tween 20均購(gòu)自北京索萊寶科技公司；GAPDH抗體、p-IKKα/β抗體、p-NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR試劑、5X All-IN-One RT MasterMix、NF-κB 抗體、TonEBP抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA 法蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于10%FBS的高糖培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)于5%CO2無菌條件下，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選取合適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒感染和篩選 針對(duì)小鼠TonEBP基因設(shè)計(jì)3種針對(duì)不同干擾位點(diǎn)的綠色熒光慢病毒干擾載體和1種綠色熒光慢病毒空載載體pHS-ASR-LW198，載體信息見表1。將Raw264.7細(xì)胞以5×105/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合至約50%密度大更換培養(yǎng)液，依據(jù)每種慢病毒滴度及預(yù)先確定的MOI值，加入適量慢病毒后繼續(xù)培養(yǎng)(空白對(duì)照組細(xì)胞不加入慢病毒)。后以嘌呤霉素篩選培養(yǎng)液連續(xù)篩選至空白對(duì)照組細(xì)胞90%以上死亡后，停止篩選，獲得三組穩(wěn)定干擾TonEBP的慢病毒感染細(xì)胞及一組陰性對(duì)照慢病毒空載細(xì)胞。之后將各組細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代。傳代3次后，提取各組細(xì)胞RNA，利用Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TonEBP 基因相對(duì)表達(dá)量，選取干擾效率最高的慢病毒感染細(xì)胞株命名為TonEBP-shRNA，野生型Raw264.7細(xì)胞株命名為Control。

表1 shRNA慢病毒靶序列

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式 為檢測(cè)高鹽刺激下TonEBP/NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控作用，設(shè)置分組，分為對(duì)照(Control)組，高鹽(HS，40 mmol/L Nacl)組，高鹽+TonEBP-shRNA(HS+TonEBP-shRNA)組，高鹽+吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC, pyrrolidinedithioearbamate，NF-κB抑制劑，HS+PDTC)組。分別將各組細(xì)胞以合適數(shù)量接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去HS組、HS+TonEBP-shRNA組和HS+PDTC組培養(yǎng)液，給予高鹽培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)。HS+PDTC組在給予高鹽培養(yǎng)液干預(yù)前2 h加入配置好的PDTC溶液，2 h后與HS組、HS+TonEBP-shRNA組同步更換高鹽培養(yǎng)液。高鹽干預(yù)24 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)各組M1、M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物基因表達(dá)情況 分組培養(yǎng)24 h后取各組細(xì)胞1×106個(gè)，分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后收取各組細(xì)胞，利用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA，測(cè)定各組RNA的純度及濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以合適倍數(shù)稀釋cDNA后采用Real-time PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)量。設(shè)置復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，目的基因相對(duì)表達(dá)量由2-ΔΔCt計(jì)算得出(ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-內(nèi)參組ΔCt)。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)各組TonEBP、pIKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2×106個(gè)，離心后留取沉淀。加入配制好的細(xì)胞裂解液吹打混勻后于冰上裂解30 min，離心后收集蛋白上清液。配制標(biāo)準(zhǔn)BCA液，按其濃度梯度，每孔加入BCA液100 μl，5 μl蛋白上清液。避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)蛋白濃度。以Loading Buffer稀釋蛋白上清液，之后于100℃恒溫器中煮沸7 min，完成蛋白變性。取蛋白樣本于SDS-PAGE分離等量蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入TBST中清洗5 min后以5%BSA溶液于搖床上室溫封閉1 h。洗膜3次，添加一抗，4℃孵育過夜。洗膜3次，加入二抗工作液，室溫條件下孵育1 h,洗膜后置于凝膠成像儀中進(jìn)行顯影，觀察各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定干擾TonEBP細(xì)胞株的建立 利用慢病毒成功感染細(xì)胞后經(jīng)篩選得到4組穩(wěn)定株。測(cè)定各組穩(wěn)定細(xì)胞株中TonEBP mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果與對(duì)照組細(xì)胞相比，編號(hào)pHS-ASR-LW222的病毒株干擾效率達(dá)70%以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，明顯高于其他組，而空載慢病毒感染組干擾效率與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TonEBP mRNA表達(dá)水平

2.2 高鹽刺激下各組M1、M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物基因mRAN表達(dá)情況 本部分實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證高鹽刺激下巨噬細(xì)胞TonEBP/NF-κB通路的激活可影響其表型偏移方向，我們檢測(cè)了各組細(xì)胞TonEBP、NF-κB、M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物TNF-α、CCL5、INOS和M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物MRC-1、FIZZ1、IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示：(1)較Control組，HS組TonEBP、NF-κB和M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的mRNA水平均明顯升高(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的mRNA水平均明顯降低(P<0.05);(2)與HS組比較，HS+ TonEBP-shRNA組、HS+PDTC組的TonEBP、NF-KB表達(dá)水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示高鹽刺激可促使小鼠巨噬細(xì)胞向M1型方向偏移，通過干擾TonEBP和NF-κB的表達(dá)可使巨噬細(xì)胞向M2型方向偏移，M1型巨噬細(xì)胞比例減少(表2)。

表2 各組細(xì)胞 TonEBP、NF-κB及表型標(biāo)志物mRNA水平

2.3 各組TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示：(1)HS組TonEBP、NF-κB、p-NF-κB、p-IKKα/β及NF-κB磷酸化比例較Control組明顯增加(P<0.05)；(2)與HS組比較，HS+TonEBP-shRNA組TonEBP蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HS+PDTC組TonEBP蛋白表達(dá)水平略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HS+TonEBP-shRNA組和HS+PDTC組的NF-κB、p-IKKα/β、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NF-κB磷酸化比例略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot對(duì)蛋白的檢測(cè)結(jié)果與mRNA的變化趨勢(shì)基本一致，提示高鹽刺激下TonEBP/NF-κB通路被激活，通過下調(diào)TonEBP的表達(dá)可有效抑制NF-κB的活化(圖2、表3 )。

圖2 Westem blot檢測(cè)TonEBP-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高鹽干預(yù)下的蛋白表達(dá)情況

表3 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

目前，心血管疾病已成為世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一，最新數(shù)據(jù)表明，它是導(dǎo)致死亡和生活質(zhì)量下降的主要原因[1]。有學(xué)者認(rèn)為，長(zhǎng)期高鈉飲食下機(jī)體組織鈉濃度超過限度會(huì)引起機(jī)體一系列炎性反應(yīng)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致以免疫系統(tǒng)失衡為特征的炎性狀態(tài)，這也是高血壓等心血管疾病的患病率近年顯著上升的一個(gè)重要原因[2]。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的主要功能細(xì)胞，其亞型比例失衡被證明與動(dòng)脈粥樣硬化、鹽敏感性高血壓等心血管疾病的發(fā)病及其靶器官損害密切相關(guān)[3]。研究表明，M1型巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的促炎因子誘導(dǎo)炎性發(fā)生引發(fā)組織損傷，因此也被稱為"促炎型"巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞則可以抑制炎性反應(yīng)，修復(fù)組織損傷，因此也被稱為“抗炎型”巨噬細(xì)胞[4,5]。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高鹽刺激可促使巨噬細(xì)胞向M1型發(fā)生偏移，同時(shí)抑制M2型巨噬細(xì)胞的活化[6,7]。研究顯示在伴隨高血壓發(fā)生的心、腦、腎等相關(guān)靶器官的損害過程中可見巨噬細(xì)胞在組織器官中大量浸潤(rùn)，且靶器官功能惡化程度與巨噬細(xì)胞亞型比例及浸潤(rùn)程度密切相關(guān)[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高鹽喂養(yǎng)下小鼠體內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞比例增加，M2型巨噬細(xì)胞比例下降，這一改變可加重小鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)、血壓升高并促進(jìn)左心室重塑的進(jìn)程。

有研究表明，在正常組織中，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)參與M1/ M2型巨噬細(xì)胞的比例的調(diào)節(jié)，由STATs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型偏移過程與IL-4、IL-13、IL-10及NF-κB等炎性因子的激活或抑制密切相關(guān)[9]，提示我們適當(dāng)?shù)难仔源碳せ蚴蔷奘杉?xì)胞表型偏移的重要推力。然而當(dāng)前有關(guān)高鹽刺激下巨噬細(xì)胞表型偏移機(jī)制的研究卻少有報(bào)道。本課題組前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高鹽刺激下小鼠巨噬細(xì)胞中TonEBP 和NF-κB的表達(dá)明顯升高，且兩者表達(dá)量呈正相關(guān)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。TonEBP是細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其不僅具有高滲環(huán)境下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能，還可在一些炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用。多項(xiàng)研究表明TonEBP、NF-κB在巨噬細(xì)胞的極化過程中發(fā)揮十分重要的作用[10,11]，由此我們推測(cè)，高鹽刺激下TonEBP/NF-κB通路的激活是導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表型偏移的機(jī)制之一。

本研究以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，通過慢病毒感染技術(shù)敲低細(xì)胞TonEBP的表達(dá)，留取TonEBP-shRNA穩(wěn)定干擾細(xì)胞株。經(jīng)測(cè)定后篩選，慢病毒感染細(xì)胞TonEBP mRNA的干擾效率達(dá)70%以上，說明感染成功可用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因巨噬細(xì)胞活化后可釋放大量炎性因子，如M1型巨噬細(xì)胞可釋放促炎型細(xì)胞因子TNF-α、iNOS、CCL5等，M2型巨噬細(xì)胞可釋放抗炎型細(xì)胞因子IL-10、MRC1、FIZZ1等[12,13]，所以我們選定以上因子分別作為M1、M2型巨噬細(xì)胞的表型標(biāo)志物，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組以上基因及TonEBP、NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量通過與對(duì)照組比較來判定Raw264.7細(xì)胞偏移方向。結(jié)果顯示單純高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號(hào)通路被激活，此條通路激活后可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞向M1型極化。進(jìn)一步干擾TonEBP/NF-κB信號(hào)通路可一定程度上改變高鹽刺激下巨噬細(xì)胞表型偏移方向。

為了進(jìn)一步證實(shí)高鹽刺激對(duì)TonEBP/NF-κB信號(hào)通路的激活作用，我們檢測(cè)了此信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)水平。在大多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB存在于胞漿中，與抑制性蛋白IK-β結(jié)合時(shí)處于無活性狀態(tài)，在受到有效刺激后IK-β激酶IKK被激活發(fā)生磷酸化，構(gòu)象發(fā)生改變，NF-κB脫落活化為p-NF-κB進(jìn)入胞核參與有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。因此我們選定TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB作為目標(biāo)蛋白，采用Western blot法測(cè)定各組蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB/ NF-κB比值，進(jìn)一步評(píng)估高鹽干預(yù)下TonEBP/NF-κB信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果提示高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號(hào)通路被激活，通過下調(diào)TonEBP的表達(dá)可有效抑制NF-κB的活化。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞中，TonEBP可通過增強(qiáng)NF-κB的活性來保護(hù)細(xì)胞免受高鹽刺激的影響[15]，說明由高鹽造成的高滲環(huán)境對(duì)NF-κB活性的刺激作用一定程度上取決于TonEBP活性。且有多項(xiàng)研究表明，NF-κB的活化是促使巨噬細(xì)胞向M1型發(fā)生極化的重要因素[16,17]。結(jié)合本研究及以上研究成果，進(jìn)一步佐證了高鹽刺激下巨噬細(xì)胞中TonEBP /NF-κB信號(hào)通路的激活是促使其向M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生偏移的重要機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號(hào)通路的激活是巨噬細(xì)胞向M1型方向偏移的可能機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)為高鹽刺激下相關(guān)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而包括鹽敏感性高血壓在內(nèi)的相關(guān)心血管疾病的發(fā)病及發(fā)展是涉及全身多個(gè)系統(tǒng)的慢性炎性過程，體外實(shí)驗(yàn)或不能全面說明問題，還需要在體實(shí)驗(yàn)的支持和佐證。同時(shí)，不同亞型巨噬細(xì)胞功能特性、其局部浸潤(rùn)程度及分泌的細(xì)胞因子或是影響機(jī)體血壓及靶器官損害程度的重要因素，有待進(jìn)一步研究。