薛云霞 范繼紅 羅丞燕 杜國豐

（營口理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 營口 115014）

木聚糖酶是一類重要的木糖苷鍵水解酶，能特異降解植物中的木聚糖[1]。木聚糖雖然廣泛地存在于秸稈，玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品中，但未能被充分利用，如在造紙工業(yè)中，富含木聚糖的廢料再利用度低，若直接排放會造成水體富營養(yǎng)化、污染環(huán)境問題[2-3]。本研究秉持“以廢治廢”的環(huán)保新理念，從堆積過玉米秸稈的土樣中篩選出能產(chǎn)生木聚糖酶的菌株，木聚糖酶菌株可將木聚糖進(jìn)一步降解成木寡糖和木糖進(jìn)行高值化利用，為工業(yè)生產(chǎn)中有用產(chǎn)品，其潛在的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義是重大的[4-6]。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

1.樣品

土壤樣品：采自遼寧營口東站附近的玉米秸稈堆積處、種植玉米的田地等處的土壤。

2.試劑

木聚糖（純度≥90%）：麥克林公司；D -木糖（純度≥99%）：天津福晨化學(xué)試劑廠；剛果紅（生物染料）：麥克林公司；3,5-二硝基水楊酸（純度≥98%）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。其他試劑均為市售分析純。

3.培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：木聚糖10g/L,蛋白胨5g/L,NaCl 5g/L。

初篩培養(yǎng)基：木聚糖5g/L,KNO30.2g/L,MgSO40.2g/L,NaCl 0.5g/L,K2HPO40.5g/L,瓊脂20g/L。

PDA 斜面培養(yǎng)基：稱取200g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000mL 煮沸，紗布過濾，濾液補(bǔ)足1000mL，再加20g 葡萄糖和20g 瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每管約5-10mL，121℃滅菌20min 取出試管擺斜面，冷卻后儲存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩培養(yǎng)基：木聚糖10g/L,(NH4)2SO41.5g/L,NaCl 5g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO40.2g/L。

（二）儀器與設(shè)備

FA2104N 電子天平：上海方瑞儀器有限公司；VIS-7220N 可見光分光光度計(jì)：上海方瑞儀器有限公司；DL-1 電子萬用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HH-6 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；K318 臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma 公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PHS-3C pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BJ-2CD 潔凈工作臺：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

（三）方法

1.產(chǎn)木聚糖酶菌株的初篩

取10g 土樣于裝有已滅菌的90mL 富集培養(yǎng)液的三角瓶中，35℃、120r/min 振蕩培養(yǎng)24h。取100μL 富集液于裝有900μL 無菌水的1.5mL EP 管中，進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-2，10-3，10-4稀釋菌液200μL，涂布初篩培養(yǎng)基平板，35℃靜置培養(yǎng)3-5 天，待平板上長出菌落后，用3mg/mL 的剛果紅染液染色10min 后倒出染液，注入1mol/L NaCl 沖洗，將平板靜置過夜，觀察菌落周圍有透明圈出現(xiàn)的單菌落，挑選到PDA 斜面培養(yǎng)基在35℃下靜置培養(yǎng)3天。將分離到的菌株再次點(diǎn)接到初篩培養(yǎng)基中，利用剛果紅染色，記錄透明圈直徑（H）和菌落直徑（C）的大小，計(jì)算 H/C 值。

2.產(chǎn)木聚糖酶菌株的復(fù)篩

將分離得到的產(chǎn)生透明圈大的菌株由斜面轉(zhuǎn)接到50mL 復(fù)篩培養(yǎng)基，35℃，150r/min 振蕩培養(yǎng)5-7 天，發(fā)酵液8000r/min 離心2min，取上清液，進(jìn)行DNS 酶活力測定。

3.D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制1 g/L D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取8 支25mL 刻度試管，分別加入D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，1.4mL，分別加入蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，制成D-木糖含量為0、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5 g/L、0.6 g/L 和0.7g/L 的溶液，最后加入1.5 mL DNS 試劑搖勻，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水定容至25 mL 并于波長540nm 下測定吸光度值。以D-木糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0869x-0.1025，相關(guān)系數(shù) R2=0.9981。

4.DNS 酶活力測定

取適當(dāng)稀釋的上清酶液0.2mL，加入1.8mL 5g/L 的木聚糖底物，于50℃水浴中反應(yīng)30min 后加入1.5mL DNS 試劑，在沸水浴中加熱5min，冷卻后定容至25mL，于540nm 波長測定吸光度值。

酶活力單位定義：在上述測定條件下，1 mL 粗酶液每分鐘水解木聚糖底物產(chǎn)生1μmol 木糖所需的酶量（U/mL）。

5.菌株的革蘭氏染色觀察

取分離純化的目標(biāo)菌株，通過涂片、固定、初染、媒染、復(fù)染，用顯微鏡油鏡觀察菌體形態(tài)。

二、結(jié)果與分析

（一）產(chǎn)木聚糖酶菌株的初篩

以木聚糖為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基經(jīng)過5 天培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基表面有大量菌落出現(xiàn)，經(jīng)剛果紅染色、NaCl 清洗，過夜培養(yǎng)，篩選出7 株產(chǎn)生透明圈的單菌落（圖1），分別標(biāo)號XFL-1、XFL-2、XFL-3、XFL-4、XFL-5、XFL-6、XFL-7。對7 株菌的 H/C 值進(jìn)行了測定、計(jì)算，結(jié)果見表1，由表1 可知，編號XFL-3 菌株的H/C 值最大，為3.41，編號XFL-2、XFL-5、XFL-6 的三株菌的H/C 值也達(dá)到2.0 以上，XFL-4 菌株的H/C 值最小，為1.23。為了進(jìn)一步鑒定菌株的產(chǎn)酶能力，通過液體復(fù)篩進(jìn)一步確定目標(biāo)菌株。

圖1 初篩平板中的菌落，經(jīng)剛果紅染色出現(xiàn)的透明圈

表1 初篩菌株的H/C 值

（二）產(chǎn)木聚糖酶菌株的復(fù)篩

進(jìn)一步對初篩得到的7 株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，利用DNS 法測定木聚糖酶活力，發(fā)現(xiàn)有6 株菌具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，其中XFL-3 菌株的木聚糖酶活力最高，達(dá)到 403.8 U/mL。 由表1 和表2 可知，有透明圈的菌株不一定具有產(chǎn)木聚糖酶能力，菌株XFL-4 未檢測出酶活，可能是由于木聚糖中不僅含有木聚糖成分，還含有少量的蔗糖、纖維素等雜質(zhì)；菌株的產(chǎn)酶能力和菌落的HC 值也不成比例（表2），綜合考慮，確定菌株XFL-3 為后續(xù)研究的木聚糖酶產(chǎn)生菌。

表2 初篩菌株的產(chǎn)酶活力

（三）菌株的形態(tài)學(xué)觀察

對XFL-3 菌株的革蘭氏染色形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌株呈紅色球狀，說明菌株XFL-3 是一株革蘭氏陰性球菌（圖2）。

圖2 菌株XFL-3 的革蘭氏染色菌體形態(tài)

三、結(jié)論與討論

利用木聚糖為唯一碳源，經(jīng)過初篩觀察透明圈、測定H/C 值、DNS 法對菌株進(jìn)行酶活力測定復(fù)篩。成功從營口東站附近的秸稈堆積處篩選出一株產(chǎn)木聚糖的菌株XFL-3，其在以木聚糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵5 天，酶活達(dá)到403.8U/mL（該處未進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化）。

本研究篩選得到的產(chǎn)木聚糖酶的菌株，后續(xù)可對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提升其產(chǎn)酶能力，有望解決產(chǎn)酶菌株匱乏，菌株產(chǎn)酶能力低的問題，可用于治理造紙等環(huán)保領(lǐng)域的環(huán)境污染。