吳小勝，崔廷婷，王兆芹，惠光鵬，趙正苗，萬宇平

可同時檢測毒死蜱、異菌脲殘留的熒光試紙條研制及其應用

吳小勝1,2，崔廷婷1,2，王兆芹1,2，惠光鵬1,2，趙正苗1,2，萬宇平2*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京）

本文利用毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體，研制出一種能夠檢測果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中毒死蜱、異菌脲的熒光免疫層析矩陣試紙條。毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料0.5 mg/kg，根莖類加工副產(chǎn)品類飼料1 mg/kg；果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中異菌脲檢測限為5 mg/kg，檢測時間為5 min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求，試紙條能夠應用到基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，并且未見同時檢測毒死蜱、異菌脲的二合一熒光免疫層析試紙條的相關文獻報道，具有創(chuàng)新性。

毒死蜱；異菌脲；熒光免疫層析試紙條；快速檢測

毒死蜱和異菌脲均屬于果蔬中典型殘留農(nóng)藥，毒死蜱是乙酰膽堿酯酶抑制劑，屬硫代磷酸酯類殺蟲劑，中毒癥狀表現(xiàn)為抽搐、痙攣、惡心、嘔吐等。異菌脲是二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型殺菌劑，對水生生物有極高毒性，可對水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響，在養(yǎng)殖過程中，動物可能通過飲食攝入，對動物造成傷害，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)。因此，研究開發(fā)毒死蜱和異菌脲的檢測技術(shù)和方法具有重要意義。

目前傳統(tǒng)檢測毒死蜱的儀器方法有比色光譜法[1]、氣相色譜法[2]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、電化學傳感器法[6]等；傳統(tǒng)檢測異菌脲的儀器方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、氣相色譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-12]等。上述儀器方法成本高，用時較長，而免疫化學檢測法具有低成本、用時較短、特異性較強等優(yōu)點[13-14]。本文制備出一種毒死蜱單克隆抗體和異菌脲單克隆抗體，將其用于制備熒光免疫層析試紙條，費用及檢測時限均能夠滿足基層實驗室的檢測需求，該產(chǎn)品已市場化，應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，保證畜產(chǎn)品質(zhì)量，具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料，購自北京某超市。

1.1.2 樣品與儀器 毒死蜱、異菌脲等標準品（純度≥95 %）購自北京標準物質(zhì)研究中心，羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；時間分辨熒光微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司；渦旋儀購自湖南湘立科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱半抗原的制備 毒死蜱原藥與氨基丁酸在四氫呋喃中加熱，反應完成后，堿溶解，萃取，水相調(diào)節(jié)pH，萃取，得到粗品，柱層析純化分離，得到半抗原產(chǎn)物[15]。

1.2.2 異菌脲半抗原的制備 以2，6-二氯-4-硝基苯酚為起始原料，經(jīng)烴基化反應，硝基還原反應，芳香胺的?；磻?，成環(huán)反應，亞胺的?；磻约笆宥□ニ獾确磻?，合成了帶有四碳鏈長度的羧基半抗原產(chǎn)物，具體方法如下[16]：

圖1 毒死蜱半抗原合成路線

化合物a的合成：5.0 g 2，6-二氯-4-硝基苯酚與3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中攪拌，加2.6無水碳酸鉀催化，60 ℃ 反應8 h。反應停止后，蒸出溶劑，加水與乙酸乙酯萃取，有機層加入無水硫酸鈉干燥，濃縮，過200-300目硅膠柱，用吸附柱色譜進行層析分離純化，得到化合物a 5.23 g，收率87 %。

化合物b的合成：鋅粉3.1 g加水20 ml，冰乙酸1 ml，90 ℃ 反應30 min，加5.2 g化合物a的乙醇溶液80 ml，60 ℃ 反應4 h。停止反應，抽濾，蒸干，加水與二氯甲烷萃取，靜置，有機層加入無水硫酸鈉干燥，石油醚/乙酸乙酯20/1重結(jié)晶，得到化合物b 4.8 g，收率91 %。

化合物c的合成：化合物b 4.7 g加乙腈100 ml溶解，攪拌，加氨基乙酸2.16 g，氮氣保護下，通入碳酰氯，50 ℃ 反應7 h。停止反應，加氫氧化鈉水溶液50 ml，震蕩，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗滌，濃縮，蒸干，過200～300目硅膠柱，用吸附柱色譜進行層析分離純化，得到化合物c 3.57 g，收率73 %。

圖2 異菌脲半抗原合成路線

化合物d的合成：化合物c 3.4 g加1，2-二氯乙烷溶解，加DMF 0.5 ml，加草酰氯3 ml，室溫攪拌3 h，旋蒸蒸干，除去有機溶劑，加吡啶80 ml溶解，80 ℃ 反應7 h。停止反應，冷卻到室溫，旋蒸，除去吡啶，加乙醇-石油醚（10:3，v/v）加熱溶解，4 ℃ 放置過夜，抽濾，得到化合物d 2.97 g，收率82 %。

化合物e的合成：化合物d 2.8 g加1，2-二氯乙烷200 ml溶解，加異丙胺2.7 ml，通入氮氣，排除空氣，通入碳酰氯，室溫攪拌反應6 h。停止反應，加KOH水溶液50 ml震蕩，靜置，分出有機相，水洗，無水硫酸鈉干燥蒸干，過200～300目硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（1:1）洗脫分離，得到化合物e 1.53 g，收率64 %。

化合物f的合成：取化合物e 1.53 g，加70 % 甲酸水溶液100 ml溶解，70 ℃ 攪拌反應6 h，停止反應，旋蒸，除去溶劑，加氫氧化鈉水溶液，加乙酸乙酯萃取，分去有機相，水相調(diào)節(jié)pH值到4，加1，2-二氯乙烷萃取，水洗，干燥，蒸干，乙醇/正己烷（6:4，v/v）重結(jié)晶，得到白色固體0.81 g，收率77 %。

1.2.3 單克隆抗體的制備 將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原。分別用毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原免疫Balb/c小鼠，免疫劑量為150 μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細胞，按8:1（數(shù)量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成1×106個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37 ℃ 水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5 ml/只，7 d后腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞株5×105個/只，7 d后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20 ℃ 保存。即得到毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體。將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與卵清白蛋白偶聯(lián)，得到毒死蜱包被原、異菌脲包被原。

1.2.4 制備毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條 1.2.3制備的毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體分別用熒光微球標記，具體方法如下：（1）取熒光微球懸液100 μl混懸于900 μl活化緩沖液中，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸微球于1 ml活化緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入適量活化劑，混勻后室溫震蕩活化10 min；（2）將（1）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于偶聯(lián)緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入10～20 μl抗毒死蜱單克隆抗體溶液/異菌脲單克隆抗體溶液（蛋白濃度1 mg/ml），混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120 min；（3）將（2）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于封閉緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后室溫震蕩封閉30 min；（4）將（3）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于貯存緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后于4 ℃ 避光保存。將上述熒光微球標記的抗體分別噴涂到試紙條的結(jié)合物釋放墊上，在檢測線1（T1線）上包被毒死蜱包被原，在檢測線2（T2線）上包被異菌脲包被原；在質(zhì)控線（C線）上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結(jié)構(gòu)，制備出毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條。

1.2.5 檢測方法 檢測前樣品應恢復至室溫，取新鮮樣品擦去泥土，剪碎成小于1 cm見方的碎片。稱取1.00 ± 0.05 g樣品至15 ml聚苯乙烯離心管中，再加入5 ml提取液，蓋上蓋子，手動上下振蕩30s，靜置1min，得樣品溶液。

用吸管吸取上述樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔，液體流動時開始計時，反應5min，通過熒光分析儀讀取檢測結(jié)果。其它時間判讀無效。

圖3 毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條

1.2.6 樣本檢測限 在空白白菜樣本中添加毒死蜱標準品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標準品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標準品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.5所述方法用三批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據(jù)實驗結(jié)果確定樣本檢測限[17]。

1.2.7 試紙條的特異性 《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：采用與待檢藥物同類藥物、類似物或可能聯(lián)合使用的藥物測定特異性，因此，分別配制10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物，用試紙條重復檢測3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.8 準確性 農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準確性[17]。取經(jīng)儀器確證的50份陰性果蔬樣品（質(zhì)量濃度小于檢測限），50份陽性果蔬樣品（質(zhì)量濃度大于檢測限），用該試紙條進行檢測毒死蜱、異菌脲藥物殘留，計算假陽性率和假陰性率[17]。《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應小于5 %，假陰性率應為零[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測限

在空白白菜樣本中添加毒死蜱標準品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標準品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標準品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.6步驟進行檢測，確定檢測限[17]。檢測白菜中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.25 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1.0 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于0.5 mg/kg濃度的毒死蜱白菜樣本；檢測馬鈴薯中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.5 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于1.0 mg/kg濃度的毒死蜱馬鈴薯樣本；檢測白菜中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲白菜樣本；檢測皇冠梨中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲皇冠梨樣本。由此可知，該試紙條的檢測限為：毒死蜱檢測限為白菜0.5 mg/kg，馬鈴薯1 mg/kg；白菜和皇冠梨中異菌脲檢測限為5 mg/kg，見表1。

表1 毒死蜱、異菌脲二合一試紙條的檢測限

注：- 表示陰性，+ 表示陽性。

2.2 特異性

該試紙條檢測10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5 %；用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求[17]。

表2 特異性測定

表3 準確性測定

2.4 關于動物飼料方面檢測的適用性

由于市場需求，本研究暫時只測定了白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本，后續(xù)研究會增加樣本進行測定。本研究制備的農(nóng)藥殘留熒光免疫層析矩陣試紙條，只需根據(jù)樣本特點調(diào)整其前處理方法，即能夠檢測出該樣本的農(nóng)藥殘留量，因此，本試紙條對于其他動物飼料方面的檢測，同樣適用。

3 結(jié)論

本文制備出的毒死蜱、異菌脲半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為5 min，比現(xiàn)有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。試紙條對毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料樣本0.5 mg/kg，根莖類加工副產(chǎn)品類飼料樣本1 mg/kg；果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本中異菌脲檢測限為5 mg/kg，靈敏度較高。該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場篩查和檢測，具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值。

[1] 李文, 孫明, 孫紅, 等. 基于比色光譜的氧樂果和毒死蜱農(nóng)藥殘留快速檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2017, 22（4）: 135-142.

[2] 陸燕, 黎施展, 石杰東, 等. 氣相色譜法測定沃柑中毒死蜱丙溴磷和三唑磷殘留的前處理方法研究[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2020, 40（15）: 20-22.

[3] 張文童, 楊嘉理, 王瑊, 等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白蟻預防工程土壤中毒死蜱及其代謝物殘留[J]. 中華衛(wèi)生殺蟲藥械, 2020, 26（4）: 383-386.

[4] 孔祥明, 魏曉琴. GC-MS/MS測定番茄中毒死蜱殘留量的不確定度評定[J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2020, 61（11）: 6-9+22.

[5] 李文. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬汁中甲霜靈、戊唑醇及毒死蜱[J]. 安徽化工, 2020, 46（3）: 109-112, 115.

[6] 周小華. 基于納米粒子摻雜-分子印跡聚合物構(gòu)筑電化學傳感器及其對環(huán)境中三聚氰胺和毒死蜱的檢測研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學, 2020.

[7] 朱文霞. 快速溶劑提取-GC-MS/MS法測定土壤中三唑磷、螺螨酯、異菌脲、氰氟草酯和多效唑[J]. 化學分析計量, 2020, 29（6）: 71-74.

[8] 義國通, 陸燕, 農(nóng)時鋒. 氣相色譜法同時測定火龍果中三唑酮·異菌脲和醚菌酯殘留[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2020, 48（10）: 171-172, 177.

[9] 趙子丹, 牛艷, 姜瑞, 等. 黃瓜及土壤中異菌脲殘留量的氣相色譜分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2015, 54（10）: 2483-2485.

[10] 張建輝, 汪濱, 宋佳, 等. 氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法測定草莓中腐霉利和異菌脲殘留量的方法比對[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技, 2019（5）: 28-29.

[11] 石妍, 顧鋼, 周挺, 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定煙葉中異菌脲殘留量[J]. 農(nóng)藥, 2019, 58（6）: 440-442.

[12] 徐秋生, 賀慧琳, 朱呂, 等. 高效液相色譜法測定番茄中腐霉利和異菌脲的殘留量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2017, 8（2）: 486-490.

[13] 吳小勝, 賈芳芳, 崔海峰, 等. 一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2020, 59（7）: 196-198, 203.

[14] 朱亮亮, 王琳琛, 王兆芹, 等. 檢測4種有機磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2019, 40（8）: 10-12.

[15] 北京勤邦生物技術(shù)有限公司. 檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用[P]. 中國專利: 2016106314162，2018-04-13.

[16] 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京勤邦生物技術(shù)有限公司. 檢測異菌脲的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用[P]. 中國專利: 2015109730273，2017-09-12.

[17] 全國獸藥殘留專家委員會辦公室. 獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序[Z]. 2013: 22-24.

（2021–03–24）

S818.9

A

1007-1733（2021）08-0013-06

典型性農(nóng)殘多靶標高效快速檢測技術(shù)研究與應用（Z181100009318006）項目資助