高攀攀，李玲子，韋良孟，莊曉峰，劉金龍，朱瑞良，魏凱*

試驗研究

2020年山東省部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況分析

高攀攀1，李玲子1，韋良孟1，莊曉峰2，劉金龍2，朱瑞良1，魏凱1*

（1.山東農業(yè)大學動物科技院，山東 泰安 271018；2.山東貝瑞康生物科技有限公司，山東 濰坊）

為了解山東省部分地區(qū)2020年6～12月份鴨圓環(huán)病毒與其他病原體感染的情況，本實驗室對從聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品進行了PCR鑒定及藥敏試驗，其中病毒檢測包括：鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、腺病毒（FAV）、鴨細小病毒（DPV）、禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、新型鴨呼腸弧病毒（NDRV）和鴨肝炎病毒（DHV）。結果表明：在130份樣品中，76份樣品檢測出病毒，其中DuCV檢出43份，約占56.58 %。86份樣品檢出細菌，占總樣本數28.46 %；DuCV與細菌混合感染37份，占DuCV陽性樣本數86.05 %。細菌單純感染時敏感藥物有四種，分別為鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林；細菌和DuCV混合感染時敏感藥物只有兩種，分別為硫酸慶大霉素和阿莫西林。說明DuCV在山東省部分地區(qū)存在著不同程度的流行，同時與細菌混合感染情況嚴重且增加了細菌的耐藥性。

鴨圓環(huán)病毒；單純感染；混合感染；檢出率

鴨圓環(huán)病毒（DuCV）是無囊膜結構的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus），基因組全長在1 900～2 000 bp堿基之間[1-2]。DuCV分兩個基因型（1型和2型），臨床感染以基因1型為主[3]。鴨圓環(huán)病毒感染機體后臨床表現為羽毛雜亂、生長發(fā)育遲緩、體重下降、免疫功能減弱、多器官生長發(fā)育不良[4]。鴨圓環(huán)病毒與豬圓環(huán)病毒相似，有著圓環(huán)病毒的共同特征，都可以感染宿主的免疫器官，在淋巴系統內增殖，從而引起免疫抑制，會使機體免疫力降低從而導致繼發(fā)感染或多重感染，使病情嚴重，死亡率增加，造成的經濟損失嚴重[5]。結合整個行業(yè)的疫情監(jiān)測結果分析來看，鴨圓環(huán)病毒在所有病毒病中感染率高居首位，并且臨床分析發(fā)現一個明顯的規(guī)律，只要存在鴨圓環(huán)病毒感染，細菌感染的程度往往非常嚴重。針對2020年6～12月份從聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品調查鴨圓環(huán)病毒和其他病原體感染情況來明確山東省部分地區(qū)鴨群中DuCV危害情況，進而為山東省養(yǎng)殖戶提供數據支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢樣品 2020年6～12月份，山東省的聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)養(yǎng)鴨場共送檢130份患病鴨的內臟（肝臟、肺臟、脾臟等），日齡均在20～ 30 d。

1.1.2 主要試劑 Biospin病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；2 × Rapid-TaqMasterMix、HisScriptⅡ1stStrandc DNA Synt-hesisKit均購自諾唯贊生物科技（南京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取 實驗人員用無菌鑷子和無菌剪刀在超凈臺中取部分肝臟、肺臟、脾臟等置于1.5 ml離心管中，加入生理鹽水，放入無菌鋼珠（2.5 mm及2 mm各一個），在全自動樣品快速研磨器中研磨2 min，參照Biospin病毒DNA/ RNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸。

1.2.2 引物 鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、腺病毒（FAV）、鴨細小病毒（DPV）、禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、新型呼腸弧病毒（NDRV）和鴨肝炎病毒（DHV）特異性擴增引物序列，生工生物工程（上海）股份有限公司提供，見表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR/RT-PCR擴增 根據表1中的特異性引物進行PCR/RT-PCR擴增，反轉錄根據HisScriptⅡ1stStrandcDNA SynthesisKit試劑盒操作；PCR反應體系為DNA模板4 μl、Mix酶10 μl、上游引物（100 μmol/L）1 μl、下游引物（100μmol/L）1 μl、雙蒸水4 μl；PCR反應程序：95 ℃ 3 min預變性；95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 15 s退火，72 ℃ 6 s延伸，循環(huán)32次；72 ℃ 5 min延伸。取10 μl擴增產物進行核酸電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1 %，將膠回收產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.4 藥敏試驗 首先無菌取部分肝臟、脾臟等置于2 ml離心管，加入生理鹽水，放入無菌鋼珠（2.5 mm及2 mm各一個），在全自動樣品快速研磨器中研磨2 min，然后將混懸液用玻璃涂布棒均勻致密的涂抹在普通培養(yǎng)皿表面，最后依次貼上磺胺間甲氧嘧啶、大觀霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸粘菌素、鹽酸多西環(huán)素、利福平、鹽酸土霉素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、痢菌凈、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、氟苯尼考、鹽酸林可霉素、氨芐西林鈉、氟甲喹鈉、安普霉素、強力霉素、青霉素、丁胺卡那霉素、甲磺酸加替沙星、阿莫西林藥敏片置于37 ℃ 溫箱培養(yǎng)16～24 h。

1.2.5 數據分析 對聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品病毒檢出率、細菌檢出率、DuCV與其他病原體混合感染情況進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 病毒和細菌總檢出率

表2 6-12月病毒和細菌總檢出率

由表2可知，山東省6～12月份，DuCV在130份樣品中檢出76份病毒，檢出率為58.46 %，細菌在130份樣品中檢出86份，檢出率為66.15%，細菌感染嚴重。在76份病毒陽性樣品中DuCV檢出43份，檢出率為56.68 %，在DuCV陽性樣品中細菌檢出37份，檢出率為86.05 %。說明DuCV感染鴨群更易造成細菌混合感染。

2.2 單個月份鴨圓環(huán)病毒和細菌檢出數

圖1 單個月份鴨圓環(huán)病毒和細菌檢出數

由圖1可知，6、7、8、9月份DuCV、細菌、DuCV和細菌混合感染檢出數明顯高于10、11、12月份DuCV、細菌、DuCV和細菌混合感染檢出數。

2.3 不同病毒的檢出數

根據以往病毒流行情況在6～12月份對130份樣品檢測了DuCV、DPV、H9N2、NDRV、DTMUV、DHV-1、DHV-3和FAV這八種病毒，從圖2可以看出，DuCV檢出數最高，DPV、H9N2、NDRV和FAV檢出數次之，DTMUV、DHV-1和DHV-3檢出數最低。

2.4 藥敏試驗

細菌單純感染、DuCV和細菌混合感染藥敏情況，見表3。

圖2 不同病毒的檢出數

表3 細菌單純感染、DuCV和細菌混合感染藥敏情況

由表3可知，細菌單純感染對藥物的敏感性高于DuCV和細菌二重感染對藥物的敏感性，細菌單獨感染時敏感藥物有4種，分別為鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林；細菌和DuCV混合感染時敏感藥物只有兩種，分別為硫酸慶大霉素和阿莫西林。

3 討論

我國養(yǎng)鴨業(yè)年出欄量已達50億只，養(yǎng)殖量占全球的80%以上，鴨肉已經成為我國繼豬肉和雞肉之后的第三大肉食品。然而，養(yǎng)鴨業(yè)目前的養(yǎng)殖現狀堪憂，養(yǎng)殖模式較為簡陋和粗放，防疫難度非常大。近幾年，鴨傳染病呈現“老病未除，新病又發(fā)”的狀態(tài)，尤其是肉鴨養(yǎng)殖后期，細菌病更是難以控制。DuCV通常以隱性感染的形式存在，無特征性癥狀和病變，它單獨感染，幾乎不會造成死亡，僅表現為料肉比下降[6]。DuCV侵入機體后感染免疫器官，造成機體抗病能力下降，被條件性致病微生物趁虛而入而造成機體發(fā)病。一旦發(fā)生混合感染，死亡率明顯增加，造成養(yǎng)殖戶經濟損失嚴重，因此對DuCV與其他病毒、細菌共感染的研究也越來越多。研究表明DuCV與鵝細小病毒共感染會增強其致病性，導致短喙－侏儒綜合征[5]。劉少寧等人研究也表明鴨圓環(huán)病毒病和鴨疫里默氏桿菌病或者大腸桿菌等細菌二重感染率達到9.57 %[7]。根據本實驗室6～12月份收集的130份樣品顯示，DuCV和細菌混合感染檢出率為86.05 %（37/43），但實際結果應高于86.05 %，是因為實驗室條件有限，只檢測了一些常規(guī)細菌，對于一些要求條件高的如鴨疫里默氏桿菌等無法進行培養(yǎng)。由此可見，DuCV與細菌混合感染在山東部分地區(qū)是極其嚴重的。同時根據不同月份感染情況統計結果顯示，DuCV、細菌、以及DuCV和細菌混合感染在6～9月份較多，說明DuCV雖然一年四季都可感染，但是在夏秋季節(jié)比較多發(fā)，可能是由于夏季雨水較多，溫度較高，濕熱的環(huán)境容易滋生病原菌。根據DuCV和細菌混合感染情況的藥敏試驗對比發(fā)現，DuCV和細菌混合感染的病料比單獨細菌感染的耐藥性更強，產生的抑菌圈更小，同時有效抗生素較少。由此可以得出，在臨床上細菌病危害嚴重與DuCV感染機體有很大關系，因此在用藥之前一定做好PCR檢測和藥敏試驗，做到對癥下藥，避免盲目用藥，增加機體腎臟、肝臟負擔以及耐藥性的產生。

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[2] 李天芝, 于新友, 張穎, 等. 鴨圓環(huán)病毒病原學特性及分子生物學診斷方法研究進展[J]. 家禽科學, 2018（8）: 40-43.

[3] Liu J, Yang X, Hao X, et al. Effect of goose parvovirus and duck circovirus coinfection in ducks. J Vet Res. 2020, 64（3）: 355-361.

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[6] Huang Juan, Yang Cui, Jia Renyong, Wang Mingshu, Chen Shun,Liu Mafeng, Zhu Dekang, Zhao Xinxin, Yang Qiao, Wu Ying, Zhang Ling, Yin Zhongqiong, Jing Bo, Cheng Anchun. Induction of a protective response in ducks vaccinated with a DNA vaccine encoding engineered duck circovirus Capsid protein.[J]. Veterinary microbiology, 2018, 225（9）: 40-47.

[7] 劉少寧, 姜世金. 鴨圓環(huán)病毒研究進展[C]. 中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會（Branch of Animal Infectious Diseases, CAAV）.中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（下冊）. 中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會. 中國畜牧獸醫(yī)學會, 2009: 424-427.

（2021–05–11）

S852.65

A

1007-1733（2021）08-0001-04

中央引導地方科技發(fā)展資金項目（YDZX20203700004857）