伊立超，婁安鋼

副豬嗜血桿菌Wza基因表達(dá)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

伊立超，婁安鋼*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

為了表達(dá)副豬嗜血桿菌Wza基因并獲得表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)，試驗(yàn)參考GenBank中發(fā)表的副豬嗜血桿菌Wza基因序列（KC795491.1）進(jìn)行重組真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Wza）的構(gòu)建，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293細(xì)胞鑒定蛋白的表達(dá)，同時(shí)分析Wza蛋白的理化性質(zhì)，并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用在線軟件預(yù)測(cè)Wza蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探究其致病性提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建pcDNA3.1-Wza質(zhì)粒，并表達(dá)Wza蛋白。理化性質(zhì)分析表明，其抗原指數(shù)較高。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是β-折疊和無規(guī)卷曲，并且有許多抗原表位區(qū)域。

副豬嗜血桿菌；Wza基因；基因擴(kuò)增；克?。焕砘再|(zhì)分析

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPs）是一種多態(tài)性，非運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏陰性微細(xì)菌，屬于巴斯德桿菌科的嗜血桿菌屬。在某些情況下，它會(huì)侵入人體并引起以纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。它已成為我國(guó)豬保育期間最普遍的繼發(fā)性細(xì)菌感染和仔豬死亡的主要原因之一，因此，找到關(guān)鍵的致病因素拮抗細(xì)菌的致病尤為重要。副豬嗜血桿菌的致病因素研究一直是該領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。目前，神經(jīng)氨酸酶、菌毛、轉(zhuǎn)鐵蛋白和脂多糖都被認(rèn)為是HPs的致病因子[1-2]。研究表明，有毒力的菌株可以抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）的吞噬作用，并且在與PAM相互作用后可以形成更明顯的莢膜；而無毒力的菌株則不能形成莢膜[3-4]。但是，一些研究還發(fā)現(xiàn)，從健康豬的上呼吸道分離出的HPs菌株也有莢膜，但從病變部位中分離出的HPs沒有莢膜產(chǎn)生，這表明HPs莢膜多糖合成基因（CapD）存在于HPs毒力菌株[1]?？傊M管莢膜多糖是巴斯德氏菌細(xì)菌的公認(rèn)毒力因子，并且已經(jīng)進(jìn)行了涉及莢膜與HPs毒力和致病性之間關(guān)系的研究，但已經(jīng)進(jìn)行了許多臨床試驗(yàn)。分離株是通過對(duì)相關(guān)毒力因子進(jìn)行比較研究得出的結(jié)論，因此除莢膜外可能還有其他毒力因子會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

目前的研究已經(jīng)完成了一些不同菌株HPs的全基因組測(cè)序，并鑒定出HPs脂多糖O抗原基因簇，該基因簇的長(zhǎng)度約為15 kb。同時(shí)，在基因簇中，已經(jīng)鑒定出Wzx，Wzy，Wzc，Wzb和Wza基因。這些基因在O抗原的加工和呈遞中發(fā)揮作用[5]，并且還在莢膜多糖的生物合成中起重要作用。其中，Wza基因在莢膜多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用[6]，Wza是完整的外膜蛋白，可為大分子量莢膜多糖的輸出提供通道[7]。Wza蛋白是由340 kDa大分子物質(zhì)組成的八聚體蛋白，其跨膜區(qū)為α螺旋，其結(jié)構(gòu)與三個(gè)新的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域相連，被認(rèn)為是一種新的具有代表性的外膜蛋白[8]。它位于該基因簇的11～12 kb之間，大小約為1 200 bp，G+C含量約為37 %。它屬于外膜跨膜通道蛋白。它嵌合在脂多糖的外部，并與其他蛋白質(zhì)如Wzc相互作用，把組裝的莢膜多糖分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌的表面。因此，本試驗(yàn)以副豬嗜血桿菌為研究對(duì)象，對(duì)Wza基因進(jìn)行真核載體的構(gòu)建與表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在為進(jìn)一步揭示W(wǎng)za蛋白的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和基因 pcDNA3.1（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存。Wza基因序列由南京金斯瑞公司合成。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒，DNA回收純化試劑盒購(gòu)自天根（TIANGEN）生化科技（北京）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific，T4 DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Wza基因引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上Wza基因（GenBank登錄號(hào)為KC795491.1）序列，N端添加6×-His標(biāo)簽，由南京金斯瑞公司合成，引物由長(zhǎng)春庫(kù)美有限公司合成。

1.2.2 Wza基因的PCR擴(kuò)增與克隆 以合成的PUC57-Wza為模板，利用引物Wza-F：5'-GCATGCATCATCACCATC-3'，Wza-R：5'-CCCTCGAGTTACCAATTCCTCACTCTTA A-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用常規(guī)分子克隆方法對(duì)Wza目的基因片段進(jìn)行純化回收，并克隆至pcDNA3.1（+）載體連接，PCR鑒定、雙酶切鑒定，均為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 Wza蛋白表達(dá)與鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Wza脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48 h收集細(xì)胞沉淀并破碎，12 000 rpm 2 min離心，收集上清，Western blot鑒定蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 Wza蛋白理化性質(zhì)分析與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)Wza蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Wza蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SWISS-model（https://swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測(cè)Wza蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wza基因PCR擴(kuò)增與克隆

以合成質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小為1180bp的Wza目的基因片段（圖1），與預(yù)期大小相同?；厥漳康臈l帶并克隆至pcDNA3.1（+）載體，PCR鑒定和雙酶切鑒定兩種方法鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒（圖2），在1 000 bp ～ 2 000 bp處可見單一條帶，表明pcDNA3.1（+）-Wza質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Wza蛋白表達(dá)

Western blot方法鑒定目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明Wza蛋白成功表達(dá)，與預(yù)期大小一致（約43 kDa）（見圖2）。

圖1 Wza基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果和雙酶切鑒定

M1.DL-2000；1-2.Wza基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.水對(duì)照；M2. DL-5000；4-5.Nhel和Xhol雙酶切結(jié)果；6.pcDNA3.1（+）-Wza

圖2 Wza蛋白表達(dá)結(jié)果

M.蛋白Marker；1-2.Wza蛋白

2.3 Wza蛋白理化性質(zhì)分析

DNAStar軟件分析顯示：Wza蛋白分子質(zhì)量約為43 kDa；其親水指數(shù)>0；抗原指數(shù)>0；表面可能性>1；肽鏈的可塑性好、活動(dòng)性強(qiáng)，容易與抗體結(jié)合。Wza蛋白具有較高的抗原指數(shù)，存在多個(gè)潛在抗原表位位點(diǎn)，見圖3。

2.4 Wza蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Wza蛋白的結(jié)構(gòu)中有22個(gè)α-螺旋且分布均勻，29個(gè)β-折疊，19個(gè)β-轉(zhuǎn)角和17個(gè)無規(guī)則卷曲，見圖4。

2.5 Wza蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SWISS-model軟件預(yù)測(cè)結(jié)果見圖5，圖6，Wza蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)果預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

圖3 Wza蛋白抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 Wza蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 Wza單體三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖6 Wza八聚體三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

副豬嗜血桿菌是常見的條件致病細(xì)菌，通常定植在上呼吸道。它的主要特征是漿膜發(fā)炎反應(yīng)，包括胸膜炎，心包炎和腹膜炎。它通常會(huì)引起腦膜炎和關(guān)節(jié)炎和肺炎[9]，稱為格拉瑟氏?。℅lasser's disease）。格拉瑟氏病在生產(chǎn)商品豬的國(guó)家中更為普遍。目前，該病已成為保育仔豬死亡的主要原因之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于莢膜多糖在革蘭氏陰性菌中是一個(gè)很重要的毒力因子，而HPs危害的嚴(yán)重性及其在這方面研究的貧乏，因此很有必要對(duì)莢膜多糖相關(guān)基因的功能進(jìn)行研究。副豬嗜血桿菌Wza基因編碼的蛋白與Wzb、Wzc等蛋白相互作用來運(yùn)輸莢膜多糖分子，Wza蛋白的外膜蛋白通常是開放的，但在其胞質(zhì)區(qū)域存在可變的環(huán)結(jié)構(gòu)，可以調(diào)節(jié)通道的打開和關(guān)閉。這種結(jié)構(gòu)為研究極性大分子莢膜多糖通過細(xì)胞膜的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建并表達(dá)了Wza基因，并通過DNAStar軟件分析得出，Wza蛋白存在多個(gè)抗原表位，Wza蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)多為β-折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)為一個(gè)完整的八聚體外膜蛋白[10]，這些研究為副豬嗜血桿菌疫苗或者拮抗劑的進(jìn)一步探究提供了依據(jù)。

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S852.61+2

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1007-1733（2021）08-0009-04

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