沈家亮，王琳，尚文強

(華北醫(yī)療健康集團峰峰總醫(yī)院骨科，河北 邯鄲 056201)

肌腱損傷是臨床上常見的一種損傷，表現(xiàn)為肌腱的退行性改變，包括脂質(zhì)沉積、蛋白糖積累和鈣化等[1]。肌腱的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其主要作用是將肌肉收縮轉(zhuǎn)化為關(guān)節(jié)運動，將力量從肌肉傳遞到骨骼[2]。盡管經(jīng)過多年的廣泛研究，損傷后肌腱結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)仍然是骨科手術(shù)和運動醫(yī)學(xué)中最大的挑戰(zhàn)之一。大量研究已經(jīng)在鼠類、兔及人類中發(fā)現(xiàn)一個新的肌腱細(xì)胞群，稱為肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs)。TSCs作為一種成熟的干細(xì)胞，能夠自我更新，并且在不同條件下可分化為肌腱細(xì)胞和非肌腱細(xì)胞(骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞)[3]。同其他肌腱細(xì)胞一樣，TSCs也能對施加在肌腱上的各種機械載荷做出反應(yīng)。并且有研究證實，持續(xù)溫和牽張應(yīng)力刺激對體內(nèi)肌腱修復(fù)可以起到顯著地促進(jìn)作用[4]。因此，施加牽張力刺激對于TSCs的作用及其在肌腱損傷治療中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，且隨著相關(guān)研究的不斷深入及干細(xì)胞治療的興起，均為肌腱病發(fā)病機制和治療的研究提供了新思路和新方向。肌腱干細(xì)胞治療肌腱損傷的機制：因為干細(xì)胞具有潛在的分化能力，而TSCs定向分化為成骨細(xì)胞能夠?qū)‰鞊p傷的治療起到較大地促進(jìn)作用。因此，本研究通過對TSCs施加不同強度、持續(xù)與間斷的牽張刺激來觀察其對TSCs肌腱分化影響，為TSCs在肌腱損傷治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及理論支撐。

1 資料與方法

1.1 大鼠肌腱干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 本研究取清潔級雄性8周齡SD大鼠10只，體重在150～200 g(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。在光照/黑暗為各12 h的恒溫環(huán)境及自由進(jìn)食飲水下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹腔麻醉后進(jìn)行原代肌腱干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)[5]。所有細(xì)胞傳代至3代后開展后續(xù)實驗。

1.2 儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(Sigma，美國)，流式細(xì)胞儀(Muse，德國)，7500Fast聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(Thermo，美國)，F(xiàn)lexcell FX5000 Tension system(Flexcell，美國)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)，酶標(biāo)儀(Molecular Device，美國)，低速離心機(Thermo，美國)，穩(wěn)壓電源(伯樂，美國)，DMEM-F12(Dulbecco's modified eagle media-nutrient mixture F-12)培養(yǎng)液(Hyclone，中國)，胎牛血清(Gicbo，澳洲)，青霉素和鏈霉素雙抗混合液(碧云天，中國)，胰蛋白酶(Taraka，中國)，細(xì)胞計數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(同仁，日本)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(TaKaRa，中國)，Trizol(BBI，中國)，SOX2一抗、OCT4一抗(CST，德國)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)一抗(Santa，美國)，增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色液(諾唯贊，中國)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)檢測試劑盒(碧云天，中國)。

1.3 方法

1.3.1 TSCs培養(yǎng)與處理 切除跟腱組織時避免殘留周圍軟組織和腱鞘組織。將取下的肌腱組織稱重，并剪碎成小塊。每100 mg組織加入1 mL Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶后置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 h，將消化液與組織碎塊充分混勻。消化結(jié)束時加入1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)吹打混勻。之后將混懸液在1 500 g/10 min條件下離心，倒掉上清液，使用含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行吹打混勻，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基混合液移入培養(yǎng)瓶中，加細(xì)胞培養(yǎng)基至10 mL，放入含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至3代后應(yīng)用Flexcell FX5000 Tension system進(jìn)行牽張力處理，參考儀器說明書，將培養(yǎng)的細(xì)胞置入處理培養(yǎng)孔內(nèi)，通過調(diào)節(jié)設(shè)置施加不同牽張力。根據(jù)不同牽張力設(shè)置四組[0(對照組)、2% Strain、4% Strain、6% Strain)]處理48h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3.2 TSCs鑒定 本研究通過對表面標(biāo)記物進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析方法進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，收集約1×107個3代細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min后棄上清；Buffer液進(jìn)行重懸，最后取100 mL細(xì)胞懸液加入1.5m LEP管內(nèi)，按量加入CD90、CD44、CD34、CD106一抗后避光孵育30min，相同的離心條件離心后[5-6]，加入300 mL Buffer進(jìn)行細(xì)胞重懸，進(jìn)樣檢測。

1.3.3 TSCs細(xì)胞活力檢測 以2×107個/mL接種到Flexcell FX5000 Tension system專用6孔板后處理48h后，以CCK-8法檢測細(xì)胞活力。每孔中加入相應(yīng)體積的溶液，混勻后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3h，之后于酶標(biāo)儀450nm波長處測吸光度(optical density，OD)值。計算細(xì)胞相對活力=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%，并進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗。

1.3.4 mRNA表達(dá)情況檢測 運用Trziol對各處理組進(jìn)行總RNA提取后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)說明進(jìn)行cDNA合成。用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒于Applied Biosystems 7500 Fast PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。檢測干細(xì)胞多能性基因SOX2、OCT4的相對表達(dá)量及成骨基因RUNX2、DLX5及COL1a的相對表達(dá)量。引物均由上海生工生物進(jìn)行合成，β-action為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3.5 免疫印跡(Western-blot，WB)法對相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測 按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，用WB法測定β-actin(內(nèi)參)、OCT4、SOX2、RUNX2蛋白表達(dá)情況。

b ALP染色細(xì)胞活性

1.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色 本研究在牽張力處理后，采用ALP試劑盒(索萊寶，中國)進(jìn)行各組細(xì)胞染色。所有染色步驟均按照試劑盒操作進(jìn)行，采用ALP活性進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

a 干細(xì)胞克隆樣生長 b 鵝卵石樣排列

2 結(jié) 果

2.1 TSCs鏡下大體形態(tài)及細(xì)胞鑒定 原代提取大鼠TSCs進(jìn)行培養(yǎng)第5天時，有部分細(xì)胞已經(jīng)開始貼壁，形態(tài)較為清晰，但沒有聚集生長成為克隆樣，細(xì)胞生長較為緩慢。但繼續(xù)培養(yǎng)至10 d時，細(xì)胞生長速度加快，細(xì)胞成鵝卵石樣的排列在瓶底，并且在培養(yǎng)瓶中可見克隆集落形成(見圖1)。

流式細(xì)胞術(shù)對TSCs細(xì)胞表面抗原鑒定的結(jié)果進(jìn)一步顯示大鼠跟腱來源的TSCs具有明確的干細(xì)胞特性。超過(97.32±4.58)%和(90.13±5.27)%的細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD44呈陽性表達(dá)，而CD34(0.37±0.09)%、CD106(0.58±0.14)%的表達(dá)很低，呈陰性(見圖2)。

圖2 TSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞檢測情況

2.2 不同牽張力處理TSCs后細(xì)胞相對活力情況 通過CCK-8法檢測后，各牽張力處理組均出現(xiàn)細(xì)胞相對活力呈上升的趨勢，但僅在牽張力為6% Strain時的細(xì)胞活力與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而其余各組的升高并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

注：*與對照組比較，P<0.05

2.3 不同牽張力處理TSCs后對干性維持基因及蛋白的影響 與對照組相比，2% Strian牽張力組的TSCs細(xì)胞SOX2基因表達(dá)開始出現(xiàn)下降，但結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，當(dāng)牽張力達(dá)到4% Strain后，SOX2基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下降(P<0.05，見圖4)。對于OCT4基因，在6% Strain牽張力處理后其表達(dá)出現(xiàn)明顯下降(P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，6% Strain組OCT4、SOX2蛋白表達(dá)量均明顯低于對照組(P<0.05)，在4% Strain組時兩者的相對表達(dá)量有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他牽張力處理組變化也不明顯(見圖5)。

2.4 不同牽張力處理TSCs后對成骨基因及蛋白的影響 與對照組相比，RUNX2基因在各組均有不同程度升高的現(xiàn)象，但僅2% Strain組和6% Strain組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DLX5基因各組均有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而在COL1a僅在6% Strain組升高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

注：*與對照組SOX2比較，P<0.05；**與對照組OCT4比較，P<0.05

注：*與對照組SOX2比較，P<0.05；**與對照組OCT4比較，P<0.05

注：*與對照組RUNX2比較，P<0.05；**與對照組COL1a比較，P<0.05

本研究對處理48h后的TSCs的RUNX2生成量進(jìn)行驗證，與對照組比較，在2% Strain和4% Strain組其生成量均有升高，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，僅在6% Strain組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖7)。

注：*與對照組比較，P<0.05

a ALP染色結(jié)果(ALP染色，×200)

2.5 不同牽張力處理TSCs后對成骨染色的影響 為進(jìn)一步探討牽張力對TSCs成骨的影響，我們通過ALP染色進(jìn)行鑒定。與對照組比較，ALP染色活性在牽張力為4%和6%時出現(xiàn)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖8)。

3 討 論

肌腱損傷是臨床上常見的一種損傷，修復(fù)后常常發(fā)生肌腱黏連或關(guān)節(jié)僵硬導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，尤其對于肌腱缺損的患者采用自體或異體肌腱移植后黏連更加明顯，因此對肌腱損傷及肌腱缺損的治療，多年來一直是骨科的一大難題[7]。由于肌腱將肌肉力量傳遞到骨骼以使身體運動而起著至關(guān)重要的作用，因此它們經(jīng)常承受機械載荷。由于肌腱是生物組織，其通過改變其新陳代謝來響應(yīng)機械負(fù)荷，并且隨著時間的流逝，這種機械生物學(xué)反應(yīng)會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和機械特性發(fā)生變化[8-12]。因此，了解TSCs如何對機械負(fù)荷做出反應(yīng)非常有意義。

有研究顯示，適度的牽張力刺激有助于TSCs的分化，并可增強TSCs向成骨細(xì)胞分化[13]。而Wang等[4]的研究也證明持續(xù)溫和牽張應(yīng)力刺激可顯著促進(jìn)體內(nèi)肌腱的修復(fù)。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。人類及動物體骨組織不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過程包括骨的分解吸收與新骨的形成[14]。因此，了解TSCs如何對機械負(fù)荷做出反應(yīng)非常有意義。深入探討適度的牽張力作用TSCs對肌腱損傷的治療及恢復(fù)至關(guān)重要。

本研究成功從大鼠跟腱組織中提取及分離出TSCs，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示所提TSCs質(zhì)量及純度相對較高，符合開展深入研究的前提條件。通過CCK-8對不同牽張力作用于TSCs后對細(xì)胞相對活力的影響結(jié)果分析，各處理組均有增高的趨勢，但僅當(dāng)牽張力為6% Strain時增高具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一部分結(jié)果顯示，適度溫和的牽張力作用有助于TSCs的生長，因此有益于肌腱損傷的治療。

在對干性維持基因的研究中發(fā)現(xiàn)，SOX2基因在4% Strain時出現(xiàn)下降，且SOX2蛋白在6% Strain處理組下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而OCT4基因僅在6% Strain處理組下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但蛋白并沒有出現(xiàn)顯著變化。這結(jié)果同前期部分研究相一致[15]。SOX2和OCT4的表達(dá)水平能夠?qū)SCs多能性的維持產(chǎn)生直接影響[16]。OCT4和SOX2既能維持細(xì)胞的自我更新，同時又能抑制分化基因的表達(dá)，維持TSCs的多能性，如果其表達(dá)量降低，TSCs則會趨于分化生長[17]。因此，本研究可以看出適度的牽張力可以加速誘導(dǎo)TSCs的分化進(jìn)程，而其加速分化能夠有效縮短肌腱損傷患者的康復(fù)時間[3]。

本研究在驗證溫和的牽張力能夠誘導(dǎo)TSCs分化后進(jìn)一步對其向成骨細(xì)胞分化進(jìn)行探討。選擇三種重要的成骨基因RUNX2、DLX5及COL1a進(jìn)行檢測[18]。結(jié)果顯示，RUNX2基因在各組均有不同程度升高的現(xiàn)象，但僅2% Strain組和6% Strain組升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而在COL1a僅在6% Strain組升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，本研究進(jìn)一步對RUNX2蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在6% Strain組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果同我國學(xué)者劉祥舟等[19]的研究相同，其通過8% Strain處理后發(fā)現(xiàn)成骨基因的RUNX2基因及蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著增高。此外有國外學(xué)者也對該強度能夠增加RUNX2表達(dá)量進(jìn)行了報道[20]。本研究在低于前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對其進(jìn)行佐證。在成骨細(xì)胞中，RUNX2能促進(jìn)早期分化，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟和血管侵入軟骨，并且抑制脂肪細(xì)胞的形成，其下游的IHH基因是重要的軟骨形成調(diào)節(jié)因子[21]。此外，我們通過ALP染色進(jìn)一步驗證了其對成骨分化的誘導(dǎo)作用。因此，RUNX2在肌腱損傷康復(fù)中扮演著重要角色。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適度溫和的牽張力有助于TSCs的細(xì)胞增殖，并且通過尋找適度的牽張力大小可以加速誘導(dǎo)TSCs的分化并具有加速其向成骨細(xì)胞分化的能力。因此，未來的肌腱損傷治療中，我們可以選擇適度溫和的牽張作用治療肌腱損傷患者，有助于肌腱病的治療及康復(fù)。