王廣闊，張秀智，王韋丹，曹放，趙德偉*

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科醫(yī)學(xué)研究中心，遼寧 大連 116001；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，遼寧 大連 116001；3.大連理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程，遼寧 大連 116024)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有歸巢能力，可被趨化遷移至損傷部位，分化為損傷部位組織成分，促進(jìn)組織修復(fù)與重建[1-3]。因此，BMSCs是再生醫(yī)學(xué)中最重要的種子細(xì)胞來(lái)源。BMSCs具有成骨分化能力[4]，BMSCs移植可被用于骨壞死、骨缺損等骨組織修復(fù)的治療中[5-6]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BMSCs可旁分泌多種細(xì)胞因子，其中包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TG-β1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)等[7]。這些因子能加快組織細(xì)胞的遷移分化，促進(jìn)組織血管的早期修復(fù)重建[8]。在骨組織損傷中，IGF-1、TGF-β1、VEGF等因子被發(fā)現(xiàn)具有影響成骨細(xì)胞活性的作用[9-10]。BMSCs可能通過(guò)旁分泌這些細(xì)胞因子參與了調(diào)節(jié)骨重建和血管生成過(guò)程來(lái)促進(jìn)骨損傷的愈合，但目前BMSCs旁分泌在骨組織修復(fù)中的作用與機(jī)制尚未報(bào)道。因此，本研究采用transwell對(duì)BMSCs與MG63進(jìn)行非接觸性共培養(yǎng)，排除BMSCs成骨分化作用的影響，單純地觀察BMSCs旁分泌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，進(jìn)而為BMSCs移植在骨缺損及骨壞死中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 培養(yǎng)基DMEM/F12(HyClone)、胎牛血清(Gibco)、胰酶、磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(HyClone)、青鏈霉素混合液(索萊寶)、茜素紅粉末(Sigma)、堿性磷酸酶試劑盒(碧云天)、Transwell小室(Corning)、引物(Takara)。

1.2 原代細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 采用梯度離心法獲取BMSCs，取2 mL分離液置于15 mL離心管內(nèi)，將1 mL抗凝血液樣本與生理鹽水1∶1比例混合，沿管壁緩慢打入離心管。此時(shí)血液樣本在分離液上層。配平后以400 g～800 g離心20～30 min。此時(shí)離心管由上至下分四層：(1)血漿層含血小板層；(2)乳白色淋巴細(xì)胞層；(3)透明分離液層；(4)紅細(xì)胞層。收集細(xì)胞于離心管中，加入DMEM/F12(HyClone)培養(yǎng)基至5 mL，配平后500 g離心20 min。棄上清，在DMEM/F12(HyClone)培養(yǎng)基、37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。類成骨細(xì)胞我們選用MG63，在DMEM/F12(HyClone)培養(yǎng)基、37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 基于Transwell(Corning 3414)：6孔板，直徑24 mm，孔隙3.0 μm。實(shí)驗(yàn)分兩組，共培養(yǎng)組：上室為BMSCs，下室為MG63細(xì)胞。對(duì)照組：上、下室均為MG63細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各組細(xì)胞按1∶1比例培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：DMEM/F12(HyClone)培養(yǎng)基、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。遷移實(shí)驗(yàn)重新分組，基于Transwell(Corning 3422)：24孔板，直徑6.5 mm，孔隙8.0 μm。共培養(yǎng)組：上室為MG63，下室為BMSCs細(xì)胞。對(duì)照組：上、下室均為MG63細(xì)胞。

1.4 遷移實(shí)驗(yàn) 基于Transwell(Corning 3422)：24孔板，直徑6.5 mm，孔隙8.0 μm。共培養(yǎng)組：上室為MG63，下室為BMSCs細(xì)胞。對(duì)照組：上、下室均為MG63細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，取出漏膜并用棉球?qū)⒛ど霞?xì)胞擦去，多聚甲醛固定6 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，用水清洗漏膜3遍。顯微鏡下觀察膜下細(xì)胞，100倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野細(xì)胞做計(jì)數(shù)，對(duì)三組均值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) MG63等量分別接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底，棄上清液后PBS清洗1次，使用10 μL移液管尖端用力在板底面均勻劃出直線，PBS清洗3次。對(duì)照組、共培養(yǎng)組上層接種細(xì)胞與下層近1∶1比例培養(yǎng)，用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24 h，使用倒置顯微鏡觀測(cè)劃痕區(qū)域中的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 使用PI/RNase染色緩沖液來(lái)檢測(cè)細(xì)胞周期。對(duì)照組、共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，棄濾膜和上清液，消化離心，計(jì)數(shù)后用PBS再洗滌一遍，-20℃條件下，70%乙醇固定1 h。再用PBS洗滌2次，按說(shuō)明書加入PI/RNase染色緩沖液(BD Biosciences，US)。37℃孵育15 min，用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 茜素紅染色 配制：0.1%茜素紅染液(ddH2O配制)，PH調(diào)制4.4。對(duì)照組、共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，棄濾膜和上清液，板底面細(xì)胞PBS清洗2次，甲醇固定6 min，ddH2O清洗2遍，0.1%茜素紅染液染色2 h，ddH2O再清洗2遍。加入2 mL PBS鏡下觀察。40倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，用image pro plus軟件分析染色陽(yáng)性面積占比后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 堿性磷酸酶染色 對(duì)照組、共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，棄濾膜和上清液，板底面細(xì)胞PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，ddH2O清洗2遍，按照堿性磷酸酶試劑盒(碧云天)說(shuō)明書配置BCIP/NBT染色液，加入500μL BCIP/NBT染色液，室溫避光孵育1 h，去除BCIP/NBT染色液，ddH2O清洗2遍。40倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，用image pro plus軟件分析染色陽(yáng)性面積占比后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 RT-qPCR檢測(cè) 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、OCN、OPN、Osterix、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)基因的引物序列。對(duì)照組、共培養(yǎng)組在共培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)14d，丟棄transwell濾膜，棄上清液，并向兩組細(xì)胞中加入Trizol試劑提總RNA，使用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(11141ES60)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (11201ES08)擴(kuò)增目的基因。引物(MMP-2、MMP-9、OCN、OPN、Osterix、RUNX2和β-肌動(dòng)蛋白基因)由Sangon Biotech(BBI，中國(guó)上海)制造(見(jiàn)表1)。使用β-肌動(dòng)蛋白基因(β-Actin)作為內(nèi)參。以β-Actin為標(biāo)準(zhǔn)，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA表達(dá)水平，行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有樣品重復(fù)3次。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定 經(jīng)過(guò)梯度離心法獲得原代BMSCs細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后換液，3～4 d后可觀察到少量散在分布的細(xì)胞，呈梭型貼壁生長(zhǎng)；5～6 d后貼壁細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)展開(kāi)；8～9 d后可觀察到培養(yǎng)瓶底部散在分布的大小不一的細(xì)胞集落，傳代后細(xì)胞增殖活性加強(qiáng)，均勻分布在培養(yǎng)瓶底部，呈長(zhǎng)梭型。傳至第3代，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示：CD34、CD45的陰性表達(dá)率分別為0.4%和0.5%，CD44、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率分別為99.9%和99.5%(見(jiàn)圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果

2.2 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 采用Transwell(Corning 3422)，成骨細(xì)胞可通過(guò)濾膜遷移。共培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)3 d后，固定染色并在顯微鏡下觀察拍照。MG63/MG63為對(duì)照組，MG63/BMSCs為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察從上室遷移到下室的成骨細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)環(huán)境下，共培養(yǎng)組膜下遷移細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明BMSCs旁分泌促進(jìn)了成骨細(xì)胞MG63的遷移(見(jiàn)圖2～3)。

圖2 遷移實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×100) 圖3 遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組、共培養(yǎng)組孵育24 h顯微鏡下觀察拍照。MG63/MG63為對(duì)照組，BMSCs/MG63為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察24 h內(nèi)運(yùn)動(dòng)到劃痕區(qū)域的成骨細(xì)胞數(shù)量來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)環(huán)境下，共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞的增殖運(yùn)動(dòng)能力明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明BMSCs旁分泌促進(jìn)了成骨細(xì)胞MG63的增殖運(yùn)動(dòng)能力(見(jiàn)圖4～5)。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100) 圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 使用流式細(xì)胞儀分析對(duì)照組、共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞的周期變化。MG63/MG63為對(duì)照組，BMSCs/MG63為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察G0/G1期、S期、G2/M期的變化來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)環(huán)境下，共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞在S期與G2/M期的細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明共培養(yǎng)環(huán)境下，共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組有明顯提高(見(jiàn)圖6)。

圖6 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

2.5 茜素紅染色檢測(cè)結(jié)果 在共培養(yǎng)環(huán)境下，將共培養(yǎng)組、對(duì)照組成骨細(xì)胞培養(yǎng)14 d后處理，并使用茜素紅S染色后在顯微鏡下觀察拍照。MG63/MG63為對(duì)照組，BMSCs/MG63為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化面積來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的礦化能力。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)環(huán)境下，共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化面積較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明共培養(yǎng)環(huán)境下，BMSCs旁分泌促進(jìn)了成骨細(xì)胞MG63的礦化能力(見(jiàn)圖7～8)。

圖7 茜素紅染色結(jié)果(茜素紅染色，×40) 圖8 茜素紅染色統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.6 堿性磷酸酶染色檢測(cè)結(jié)果 在共培養(yǎng)環(huán)境下，將共培養(yǎng)組、對(duì)照組成骨細(xì)胞培養(yǎng)14d后處理，并使用堿性磷酸酶試劑盒染色后在顯微鏡下觀察拍照。MG63/MG63為對(duì)照組，BMSCs/MG63為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察成骨細(xì)胞染色陽(yáng)性面積來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明共培養(yǎng)環(huán)境下，BMSCs旁分泌提高了成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性(見(jiàn)圖9～10)。

圖9 堿性磷酸酶染色結(jié)果(堿性磷酸酶染色，×40) 圖10 堿性磷酸酶染色統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

2.7 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果 MG63/MG63為對(duì)照組，BMSCs/MG63為共培養(yǎng)組，通過(guò)觀察成骨相關(guān)基因OCN、OPN、Osterix、RUNX2與遷移相關(guān)基因MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估BMSCs旁分泌對(duì)成骨細(xì)胞成骨活性的影響。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組的MMP-2、MMP-9、OPN、Osterix、RUNX2基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但共培養(yǎng)組的OCN基因表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果說(shuō)明共培養(yǎng)環(huán)境下，BMSCs旁分泌上調(diào)了成骨細(xì)胞的MMP-2、MMP-9、OPN、Osterix、RUNX2等基因的表達(dá)(見(jiàn)圖11)。

圖11 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

BMSCs具有成骨與成血管等多向分化潛能，因此BMSCs移植被應(yīng)用于骨壞死與骨缺損的治療中，并顯示了良好的效果[5-6]。另一方面，BMSCs除具有多向分化潛能外，還具有旁分泌調(diào)節(jié)功能，BMSCs可旁分泌IGF-1、VEGF、TGF-β1、HGF等多種細(xì)胞因子[7]，BMSCs旁分泌作用可能在骨修復(fù)與骨再生治療中起到積極的作用。因此，本研究采用transwell法對(duì)BMSCs與類成骨細(xì)胞MG63行非接觸性共培養(yǎng)，通過(guò)排除BMSCs成骨分化的影響，單純觀察BMSCs旁分泌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，從而完善BMSCs移植在骨壞死與骨缺損治療中的應(yīng)用理論基礎(chǔ)。

為了驗(yàn)證BMSCs旁分泌的成骨誘導(dǎo)性，本實(shí)驗(yàn)采用了茜素紅染色[11]、堿性磷酸酶染色[12]等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，傳統(tǒng)使用條件培養(yǎng)基方法無(wú)法真實(shí)模擬旁分泌功能，所以實(shí)驗(yàn)采用了transwell非接觸共培養(yǎng)方法模擬了BMSCs長(zhǎng)期的旁分泌的過(guò)程[13]。Osterix、RUNX2、OPN是關(guān)鍵成骨分化標(biāo)記物的基因[14]，研究中我們發(fā)現(xiàn)BMSCs通過(guò)旁分泌上調(diào)了成骨細(xì)胞的成骨相關(guān)基因Osterix、RUNX2、OPN的表達(dá)，從而顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨活性，而B(niǎo)MSCs旁分泌對(duì)OCN基因的表達(dá)無(wú)影響。細(xì)胞周期、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，BMSCs旁分泌提高了成骨細(xì)胞的增殖能力、早期成骨與成骨礦化能力。此外，成骨細(xì)胞趨化遷移到損傷部位，在損傷部位增殖、礦化是骨組織修復(fù)和再生的前提條件，MMP-2、MMP-9在成骨細(xì)胞的趨化和遷移中具有重要作用[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMSCs通過(guò)旁分泌上調(diào)了成骨細(xì)胞的遷移相關(guān)基因MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而顯著提高成骨細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs旁分泌對(duì)成骨細(xì)胞具有趨化作用，并且BMSCs旁分泌能顯著提高成骨細(xì)胞趨化遷移運(yùn)動(dòng)能力。

BMSCs成骨分化是骨組織修復(fù)與重建的途徑之一，但BMSCs的成骨分化需要特定的微環(huán)境與較長(zhǎng)的分化時(shí)間[16]。而B(niǎo)MSCs旁分泌可能在骨組織損傷的早期修復(fù)中具有更為重要的作用。BMSCs旁分泌調(diào)節(jié)過(guò)程起始快，促進(jìn)各組織之間聯(lián)合修復(fù)，是修復(fù)過(guò)程的早期動(dòng)員和重要開(kāi)始。因此，調(diào)控BMSCs旁分泌可以促進(jìn)骨組織損傷早期修復(fù)，縮短修復(fù)與重建時(shí)間，將為臨床早期治療骨組織損傷提供新的思路。

綜上所述，BMSCs旁分泌促進(jìn)了成骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移、增殖分裂、鈣化成骨能力。研究結(jié)果表明BMSCs除具有成骨分化能力外，還具有增強(qiáng)周圍成骨細(xì)胞骨修復(fù)活性的旁分泌功能，為BMSCs移植在骨缺損及骨壞死中應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。