穆元忠， 郭虎林， 楊世榮， 趙剛， 陶濤

膀胱癌是一類發(fā)病率較高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其主要類型是非肌層浸潤性膀胱癌，該類膀胱癌的復(fù)發(fā)率高，是威脅患者安全與健康的極大隱患[1]。研究能預(yù)防及監(jiān)測非肌層浸潤性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)甚至病情發(fā)展的手段是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。膀胱癌的治療方法主要是腫瘤病灶的局部切除結(jié)合化療藥物經(jīng)膀胱灌注，其中經(jīng)尿道膀胱癌等離子電切術(shù)聯(lián)合吉西他濱治療是使用較多的方法。與傳統(tǒng)的單手術(shù)切除法或單純放、化療方法相比，放療與化療聯(lián)合的治療效果更優(yōu)，但預(yù)后仍不盡如人意，尚有較大的改善空間，因此，探究影響腫瘤發(fā)病的相關(guān)基因，從生物遺傳學(xué)角度認(rèn)識膀胱腫瘤發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，是臨床診斷及治療的根本方向[2-4]。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控作用的內(nèi)源性小分子RNA，其一般表達(dá)于基因轉(zhuǎn)錄之后。研究表明miRNA可以在腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)活動的多個(gè)過程中起不同作用，具有保守性、時(shí)序性及生物學(xué)特異性等特征[5-7]。有學(xué)者提出miRNA是一種另類的基因調(diào)控方式，有些miRNA(如miRNA-23a、miRNA-218等)的表達(dá)與腫瘤術(shù)后的效果相關(guān)[8-9]。miR-30b及miR-92a是近年來發(fā)現(xiàn)的異常表達(dá)于腫瘤組織或細(xì)胞中的特殊miRNA，二者均能抑制癌細(xì)胞生長[10-11]，但目前關(guān)于miR-30b及miR-92a與膀胱癌關(guān)系的研究較少。本研究選取85例膀胱癌患者，采用經(jīng)尿道膀胱癌等離子電切術(shù)聯(lián)合吉西他濱治療，通過檢測其血清miR-30b、miR-92a水平，探討其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年10月于青海省第五人民醫(yī)院確診并治療的85例膀胱癌患者(膀胱癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)腹部B超、尿路造影及磁共振確診非肌層浸潤性膀胱癌；②經(jīng)膀胱鏡檢查及活檢，采用2016年WHO出版的泌尿系腫瘤病理分類及2017年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，確診為Ta或T1期非肌層浸潤性膀胱癌；③膀胱癌首次就診者；④膀胱癌未轉(zhuǎn)移；⑤患者一般資料完整；⑥受試者及家屬均知情并簽署受試同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①受試前進(jìn)行過手術(shù)或放化療；②合并膀胱癌其他并發(fā)癥或血液系統(tǒng)疾病或其他腫瘤者；③不配合預(yù)后檢查者；④行二次及以上電切術(shù)者。選取同期進(jìn)行健康體檢者57人為對照組，兩組研究對象的性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 膀胱癌組和對照組患者一般資料比較

1.2 主要藥品及儀器 吉西他濱(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030105，規(guī)格：0.2 g，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；RGL-2000A型體腔熱灌注治療機(jī)(吉林邁達(dá)醫(yī)療器械股份有限公司)、總RNA提取試劑盒(上海一基實(shí)業(yè)有限公司)、分光光度儀(上海向帆儀器有限公司)。

1.3 膀胱癌治療方法 行經(jīng)尿道膀胱癌等離子電切術(shù)切除腫瘤組織直至深層肌，同時(shí)切除距離膀胱腫瘤組織2 cm周圍的膀胱內(nèi)黏膜組織。于電切術(shù)后1 d內(nèi)用吉西他濱對患者膀胱進(jìn)行灌注，首先每周灌注1次，持續(xù)6周；然后每兩周灌注1次，持續(xù)12周；最后每月灌注1次，持續(xù)6個(gè)月；每次灌注后保留時(shí)長為1 h。具體方法：用50 ml生理鹽水溶解1 000 mg吉西他濱，通過放置好的導(dǎo)尿管將吉西他濱稀釋液灌注于患者的膀胱中。指導(dǎo)患者定時(shí)翻身(仰臥、俯臥、兩邊側(cè)臥和坐位)，以使吉西他濱藥液均勻地附著在患者的膀胱黏膜上皮上，1 h后導(dǎo)出灌洗液。

1.4 qPCR法檢測兩組受試者血清miR-30b、miR-92a水平 于入院第2天清晨抽取受試者肘靜脈血5 ml，靜置1.5 h左右，離心操作得到血清，用試劑盒提取總RNA，用分光光度計(jì)檢測RNA的濃度、純度。以U6為內(nèi)參照，引物序列見表2。按如下qPCR操作流程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸1 min，檢測血清中miR-30b、miR-92a的相對表達(dá)水平。

表2 miR-30b、miR-92a的引物

1.5 預(yù)后評估及隨訪 通過電話詢問方式對患者預(yù)后情況進(jìn)行隨訪，共隨訪40個(gè)月，若有復(fù)發(fā)則停止隨訪。每3個(gè)月進(jìn)行一次膀胱鏡檢查，取膀胱組織于顯微鏡下觀察復(fù)發(fā)情況。每3個(gè)月進(jìn)行一次B超及X線片檢查，對疾病進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)測。記錄患者血小板下降、膀胱刺激、脫發(fā)及嘔吐癥狀等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組治療前與對照組血清miR-30b、miR-92a水平比較 膀胱癌患者治療前的血清miR-30b、miR-92a表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表3)。

表3 膀胱癌組治療前與對照組血清miR-30b、miR-92a水平比較

2.2 膀胱癌患者治療前后血清miR-30b、miR-92a水平比較 膀胱癌患者治療后血清miR-30b、miR-92a表達(dá)水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表4)。

表4 膀胱癌患者治療前后血清miR-30b、miR-92a水平比較

2.3 miR-30b、miR-92a水平與患者預(yù)后的關(guān)系

以膀胱癌患者治療后的血清miR-30b表達(dá)水平(8.97)為界，將85例膀胱癌患者分為miR-30b高表達(dá)組(miR-30b>8.97)45例，miR-30b低表達(dá)組(miR-30b≤8.97)40例；行Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：miR-30b低表達(dá)組治療后的中位無進(jìn)展生存期(20.41個(gè)月)低于miR-30b高表達(dá)組(31.55個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，圖1)。以膀胱癌患者治療后的血清miR-92a表達(dá)水平(0.99)為界，將85例膀胱癌患者分為miR-92a高表達(dá)組(miR-92a>0.99)48例，miR-92a低表達(dá)組(miR-92a≤0.99)37例；行Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：miR-92a低表達(dá)組治療后的中位無進(jìn)展生存期(24.88個(gè)月)低于miR-92a高表達(dá)組(32.65個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015，圖2)。

圖1 miR-30b高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線

圖2 miR-92a高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線

2.4 miR-30b、miR-92a高低表達(dá)組患者的不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 miR-30b高表達(dá)組與低表達(dá)組患者治療后的不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表5)；miR-92a高表達(dá)組患者治療后的不良反應(yīng)發(fā)生率低于miR-92a低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表6)。

表5 miR-30b高表達(dá)組與低表達(dá)組不良反應(yīng)發(fā)生率比較 [例(%)]

表6 miR-92a高表達(dá)組與低表達(dá)組不良反應(yīng)發(fā)生率比較 [例(%)]

3 討論

近年來，膀胱癌的發(fā)病率因吸煙和接觸芳香胺致癌物質(zhì)而顯著增加。在我國，膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[12]。在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，尿路上皮組織癌變?nèi)藬?shù)占膀胱癌總發(fā)病人數(shù)的九成左右，并且大部分患者初次就診就檢出淺表膀胱癌，該類癌癥未觸及膀胱深肌層，可分為未浸潤乳頭狀癌及膀胱原位癌等，患者的臨床癥狀可表現(xiàn)為消瘦、腹部不適、尿液中帶血及困乏等，對健康及生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響。膀胱癌的性質(zhì)復(fù)雜，具有發(fā)展快、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，當(dāng)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)疾病危險(xiǎn)系數(shù)加大，每年約有10萬人以上因患膀胱癌而死亡[13]。膀胱癌治療時(shí)間長，治療費(fèi)用高，嚴(yán)重危害患者的身心健康，并對家庭及社會造成很大壓力，所以探尋合適的治療方案是當(dāng)前膀胱癌治療的熱點(diǎn)。

目前臨床治療淺表型膀胱癌的常用方法為電切聯(lián)合膀胱灌注化療法，淺表型膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)可能性大，復(fù)發(fā)可導(dǎo)致腫瘤向肌層浸潤性膀胱癌轉(zhuǎn)化，腫瘤發(fā)生進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)極高，使得膀胱癌特異性病死率升高。臨床常采用經(jīng)尿道膀胱癌等離子電切術(shù)治療膀胱癌，該手術(shù)有創(chuàng)面小、手術(shù)難度不大且患者易接受等優(yōu)點(diǎn)，但其主要缺點(diǎn)為無法完全清除膀胱癌組織，對于微小的腫瘤增生上皮組織無法切除，導(dǎo)致手術(shù)后的預(yù)后較差[4,14]。在電切術(shù)后使用吉西他濱灌注膀胱能起到較好的治療效果，但仍需要尋找合適的標(biāo)志物對其進(jìn)行檢測和評估，以此判斷個(gè)體差異，并及時(shí)調(diào)整手術(shù)治療方案。部分miRNA在癌組織與機(jī)體正常組織中的表達(dá)水平有明顯差異，研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNA位于脆弱基因位點(diǎn)之上，證明miRNA對癌癥的發(fā)展進(jìn)程作用明顯[15-16]。

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-30b及miR-92a在膀胱癌中表達(dá)異常[17-19]，本研究分析經(jīng)尿道等離子電切術(shù)聯(lián)合吉西他濱膀胱灌注治療前后膀胱癌患者血清miR-30b、miR-92a變化水平，結(jié)果顯示膀胱癌患者血清miR-30b、miR-92a表達(dá)水平較對照組均明顯降低，提示miR-30b、miR-92a與膀胱癌的形成有關(guān)。膀胱癌患者治療后血清miR-30b及miR-92a表達(dá)水平較治療前顯著上升，說明膀胱癌患者治療后的血清miR-30b、miR-92a表達(dá)水平向健康水平變化，手術(shù)治療使膀胱癌患者機(jī)體逐漸轉(zhuǎn)歸。以膀胱癌患者治療后的血清miR-30b表達(dá)水平(8.97)及血清miR-92a表達(dá)水平(0.99)為界，將患者分為miR-30b高表達(dá)組及miR-30b低表達(dá)組，miR-92a高表達(dá)組及miR-92a低表達(dá)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30b低表達(dá)組、miR-92a低表達(dá)組治療后的中位無進(jìn)展生存期(20.41、24.88個(gè)月)均低于miR-30b、miR-92a高表達(dá)組(31.55、32.65個(gè)月)，提示miR-30b、miR-92a均可作為監(jiān)測膀胱癌預(yù)后的血清學(xué)標(biāo)志物，二者高表達(dá)對該腫瘤的預(yù)后有一定改善作用。miR-92a高表達(dá)組治療后的不良反應(yīng)發(fā)生率比miR-92a低表達(dá)組低，說明miR-92a還影響到膀胱癌患者的用藥不良反應(yīng)，但不良反應(yīng)與機(jī)體的耐受情況也有關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，膀胱癌患者經(jīng)尿道膀胱癌等離子電切術(shù)聯(lián)合吉西他濱膀胱灌注治療前后的血清miR-30b、miR-92a水平變化明顯，血清miR-30b、miR-92a低水平提示患者預(yù)后較差，提高二者水平對于改善患者預(yù)后意義重大。但本研究納入患者的樣本量有限，且均為中國人，關(guān)于miR-30b、miR-92a對膀胱癌預(yù)后的確切作用尚需進(jìn)一步探討。