李燕菊 馮杰 韓忠誠 趙婷 李紅健 馬俊鵬 孫力 瑪爾江·巴哈提別克 王燕 于魯海

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部, 新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)臨床藥學研究所，新疆 烏魯木齊 830001；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830001)

肝纖維化是肝臟長期處于炎癥損傷狀態(tài)并進展為肝硬化的一種病理生理過程，如不及時干預，可能會并發(fā)腹水、肝性腦病、肝腎綜合征等全身多組織器官病變，甚至會進展為肝癌等嚴重疾病[1-2]。水飛薊賓為從菊科植物水飛薊[Silybummarianum(L.) Gaertn.]中提取得到的一種天然產物，具有抗炎、抗病毒等作用[3]。近年來有文獻報道[4]，水飛薊賓在肝纖維化的臨床治療中表現(xiàn)出顯著療效。本研究通過探討水飛薊賓對肝纖維化大鼠的作用及機制，旨在為水飛薊賓在肝纖維化治療中的藥理作用機制提供依據，并為水飛薊賓的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠45只，6～8周齡，體重180～200 g，購買于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于實驗動物房，動物房溫度保持在20～24 ℃，濕度為40%～60%。本實驗經新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，符合動物試驗倫理學要求。

1.2 藥品及試劑 水飛薊賓(北京索萊寶科技有限公司，貨號：IS0160，純度>98%)；硫代乙酰胺(北京索萊寶科技有限公司，貨號：T8700，純度>98%)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1340)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒HA(上海信裕生物科技有限公司，貨號：CEA182Ge)、PCⅢ(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：YS03777B)、LN (上海和序生物科技有限公司，貨號：EK0435)、ColⅣ酶ELISA檢測試劑盒(默瑞生物科技有限公司，貨號：KT-32025)；RIPA蛋白裂解液(貨號：P0013B)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號：P0018M)、TGF-β1兔單克隆抗體(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號：LM-0086R)；Smad3、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (上海碧云天生物科技有限公司，貨號：AF1501、AF1186、A0208)；蘇木素染液、伊紅染液(北京諾博萊德科技有限公司，批號：ZLI-9610、ZLI-9613)。

1.3 儀器及設備 Axio Imager M2M倒置顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)；TG18-WS臺式高速冷凍離心機(湖南湘鑫儀器儀表有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國伯樂生命醫(yī)學有限公司)；S700半自動石蠟切片機(瑞沃德生命科技有限公司)；DYCZ-24DN雙垂直電泳槽(山東博科再生醫(yī)學有限公司)；SD1-BS全自動生化分析儀(成都斯馬特科技有限公司)。

1.4 肝纖維化大鼠模型的建立 45只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組及水飛薊賓組，每組15只。參照文獻方法[5-6]，除對照組外，其余大鼠按照200 mg/kg腹腔注射給予硫代乙酰胺，隔天1次，連續(xù)給予7周，對照組大鼠腹腔注射給予等量生理鹽水。造模結束后隨機抽取3只大鼠，麻醉后取肝組織，并采用HE染色法檢查肝組織病理學變化，以大鼠血清清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)水平顯著高于對照組，同時肝組織出現(xiàn)明顯病理學改變視為造模成功。水飛薊賓組根據體重按照75.6 mg/kg的劑量灌胃給予大鼠水飛薊賓[7-8]，對照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，1次/d，給藥6周[8]。

1.5 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平檢測 大鼠末次給藥24 h后，眼眶后靜脈叢取血至離心管中，4℃靜置4 h，以4℃，3500 rpm離心10 min，取上清液，使用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平檢測 腹腔注射給予10%水合氯醛(3 mL/kg)對大鼠麻醉后固定，取仰臥位，腹主動脈取血至離心管，4℃靜置4 h，3500 rpm離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)水平。

1.7 各組大鼠肝組織病理學檢查 大鼠處死后分離肝組織， 10%中性甲醛中固定24 h，脫水、透明處理后，浸蠟、包埋、 5 μm切片，將石蠟切片依次經過脫蠟、復水、蘇木精染色、分化、伊紅染色等步驟進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色)及Masson染色，在顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.8 Western blot檢測大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平 取各組大鼠肝組織，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進行勻漿，以4 ℃，12000 rpm離心10 min，取上清液，加入上樣緩沖液，混勻后置于100 ℃水浴5 min變性。BCA法測定蛋白濃度后，取50μg蛋白進行電泳分離，經轉膜、封閉液封閉后，TGF-β1、Smad3及GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝膠成像儀成像后，使用Image J 1.52v軟件進行灰度值檢測及分析。

2 結果

2.1 大鼠ALT、AST、ALP及GGT水平 模型組肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組血清ALT、AST、ALP、GGT水平降低(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平比較 模型組肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝組織病理學檢查 對照組大鼠肝組織細胞形態(tài)結構正常，肝組織未見明顯病理學變化；與對照組比較，模型組大鼠肝組織細胞排列不整齊，部分細胞壞死、脫落，存在膠原沉積，膽管增生，纖維組織增多，中心靜脈輕度擴張充血，提示造模成功；與模型組比較，水飛薊賓組大鼠肝組織病理學變化出現(xiàn)不同程度的改善，水飛薊賓組大鼠肝組織細胞排列較整齊，中心靜脈充血減輕，纖維組織減少。各組大鼠肝組織病理學檢查結果，見圖1～2。

圖1 大鼠肝組織HE染色結果(200×)

2.4 大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平比較 模型組肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平較對照組大鼠顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組TGF-β1、Smad3水平降低(P<0.05)，見圖3。

圖2 大鼠肝組織Masson染色結果(200×)

圖3 大鼠肝組織TGF-β1及Smad3蛋白水平

3 討論

肝纖維化是由病毒性肝炎、自身免疫性疾病及藥物性原因引起的肝組織細胞損傷，且誘發(fā)因素長期不能去除，導致肝組織細胞長期處于炎癥狀態(tài)，進而疾病進展為肝纖維化。腹腔注射硫代乙酰胺是目前實驗室常用的建立肝纖維化動物模型的方法之一，并且具有方便、安全、造模成功率高等特點[9]。

水飛薊賓是從植物水飛薊的果實中提取得到的一種單體化合物，對肝炎、肝硬化等多種疾病具有一定的療效[10]。劉凱南等[11]研究表明，水飛薊賓聯(lián)合常規(guī)治療能夠改善酒精性肝病患者的肝功能，抑制患者體內肝纖維化因子水平，且療效優(yōu)于常規(guī)治療。陳偉平[12]報道了水飛薊賓聯(lián)合抗病毒藥物替諾福韋能夠降低慢性乙型肝炎患者肝硬度，緩解肝纖維化進展,這提示水飛薊賓在肝纖維化的治療中表現(xiàn)出巨大的潛力。

臨床中常使用ALT、AST、ALP、GGT等指標評價肝功能，其水平的升高提示肝組織細胞受損及肝功能下降[13]。本實驗結果表明，模型組肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平較對照組升高，提示造模成功，然而給予大鼠水飛薊賓及秋水仙堿后，血清ALT、AST、ALP、GGT水平較模型組降低。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者體內HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平升高，提示HA、LN、PCⅢ、ColⅣ等因子均參與肝纖維化的過程[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能夠顯著降低肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平，進而緩解大鼠肝纖維化進展。

TGF-β1通路是參與細胞增殖分化及細胞動態(tài)平衡的重要信號通路[15-16]，Smad3是TGF-β1下游的重要信號基因[17]。TGF-β1的激活能夠活化Smad3蛋白，并能夠誘導和促進表達TGF-β1及Smad3組織器官的上皮間質轉化和纖維化，在肺、腎、肝等器官的纖維化過程中尤為重要[18]。李文庭等[19]研究表明，乙型肝炎病毒誘導肝纖維化的過程與激活TGF-β1信號通路的過程相關；郭輝等[20]研究表明，肝纖維化與TGF-β1/Smads信號通路的異常激活密切相關，抑制TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白的表達能夠緩解肝纖維化的進展及預后。以上研究提示對于肝纖維化的治療，抑制TGF-β1/Smads通路及其相關蛋白的異常激活可能具有重要作用。本實驗結果表明，肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平較模型組升高，給予大鼠水飛薊賓后，大鼠肝組織TGF-β1、Smad3水平均降低，提示水飛薊賓對肝纖維化大鼠的改善作用可能是通過調節(jié)TGF-β1/Smad3信號通路實現(xiàn)的。本研究證實，水飛薊賓對肝纖維化大鼠TGF-β1/Smads通路具有顯著的調節(jié)作用，為水飛薊賓在肝纖維化治療中的作用機制提出新的證據。但未能深入探討水飛薊賓對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1/Smad3通路的靶向調節(jié)作用，擬在今后研究中進行深入探討。

4 結論

水飛薊賓能夠明顯改善硫代乙酰胺誘導的肝纖維化大鼠肝功能，抑制肝纖維化因子水平，改善大鼠肝組織病理學進展，其機制可能與調節(jié)TGF-β1/Smad3信號通路有關。